圈门

hebiorange

请问一下， 我用不同浓度IL-2 刺激splenocyte, CD45 和CD3 gate 时发现， 在不同的位置上， 那我是要调整 不同gate 的位置么？

niwanmao

CD3分群没分开，是否需要先从抗体滴度上下功夫？

hebiorange

niwanmao 发表于 2022-8-24 19:37
CD3分群没分开，是否需要先从抗体滴度上下功夫？

不瞒您说， 这个抗体是滴定过的，相同滴度情况下，同样也在splenocyte, 在其他sample 分开了， 不知道为啥这次没分开。

hebiorange

niwanmao 发表于 2022-8-24 19:37
CD3分群没分开，是否需要先从抗体滴度上下功夫？

一开始 也怀疑是 抗体浓度不对导致的，但是吧 同样的条件，有的sample CD3 就分的特别好。 可以再 double check 这个滴度的问题，再试试。倪老师 还会有其他会导致么？  IL -2 刺激 会影响 CD3 么？

hebiorange

niwanmao 发表于 2022-8-24 19:37
CD3分群没分开，是否需要先从抗体滴度上下功夫？

倪老师， 还有个 就是 因为这批sample  是经历了两次的固定 破膜的， 不知道 会不会有影响？  倪老师，有推荐的 foxp3 和 pstat5 共染的方法么？谢谢了

niwanmao

hebiorange 发表于 2022-8-24 22:55
倪老师， 还有个 就是 因为这批sample  是经历了两次的固定 破膜的， 不知道 会不会有影响？  倪老师，有 ...

BD有个专门的磷酸化蛋白染色试剂盒，可以试试看。

目前看来应该是固定、破膜的影响了。

Climber

CD3-A700不是很亮这很正常，另外T细胞在体外刺激等条件下CD3下调很正常，我们的方案是连用CD5用CD3 CD5双阳的定义为T细胞，在小鼠来源的免疫器官细胞单用CD3一般很难有较好的分群，血液除外，这里附上我们的效果图

hebiorange

Climber 发表于 2022-8-27 10:56
CD3-A700不是很亮这很正常，另外T细胞在体外刺激等条件下CD3下调很正常，我们的方案是连用CD5用CD3 CD5双阳 ...

谢谢 您的讲解，准备按照您说的 试一下。 另外还有个问题，要请教一下， 因为要看Treg 下pSTAT5 的信号，所以经历了两次固定破膜，发现了CD3 表达在经历了两次固定破膜后，出现了不同的表达，[img][/img]  
我能得出结论是 两次固定破膜   影响了 CD3的 表达么 ？ Foxp3 staining follow eBiosience Foxp3 Transcription Factor Staining kit, and pSTAT5 staining follow 2% PFA fix and prechilled 90% methanol perm , 不知您怎么看 谢谢您的指导。

Climber

hebiorange 发表于 2022-8-28 11:39
谢谢 您的讲解，准备按照您说的 试一下。 另外还有个问题，要请教一下， 因为要看Treg 下pSTAT5 的信号， ...

不同的固定打孔方案的确会影响膜表面蛋白的稳定性，首先Foxp3的打孔试剂盒不会影响CD3，而90%甲醇打孔会导致145-2C11克隆号的CD3下调，可参考https://www.thermofisher.cn/cn/z ... considerations.html