血小板活化流式，CD62p可以不用同型对照吗？

lizhiyu

小弟我现在正好在做血小板活化的流式，有几个问题想咨询下坛里的各位。
我用的是最常见的BD的血小板活化的Protocol https://www.bdbiosciences.com/en ... platelet-activation
主要是三种颜色：FITC PAC-1； PE CD62P ； APC CD61。  用CD61圈血小板门后，看门内PAC-1和CD62p的阳性情况

问题：由于我做的是不对血小板进行额外刺激的检测，对比患者和健康人血小板活化的差异，因此CD62p的阳性率本来就不是很高，不会像用ADP刺激后那么明显。然后现在的问题就是PE IgG（使用的是CD62p说明书上推荐的货号）的同型对照总是比CD62p的阳性率更高，即使在IgG只加一半量的情况下也是如此（我按照说明书都是各加20ul）。

我之前看了论坛里的文章，包括我们实验室做别的细胞的也有许多人有类似问题。另外看到倪老师之前有发文章讲到同型对照的不可靠。因此我想问一下，在加FC block的前提下，可否不实用同型对照，而使用FMO对照（即CD61 APC+ PAFC-1 FITC）作为PE CD62p的阴性对照呢？

niwanmao

可以的。
另外，其实还可以考虑另一个指标对比，就是CD62p的平均荧光强度

lizhiyu

niwanmao 发表于 2020-10-28 09:29
可以的。
另外，其实还可以考虑另一个指标对比，就是CD62p的平均荧光强度

好的，感谢！

overcome1996

niwanmao 发表于 2020-10-28 09:29
可以的。
另外，其实还可以考虑另一个指标对比，就是CD62p的平均荧光强度

@niwanmao 倪老师，如果用平均荧光强度的话，还需要做FMO对照吗？
是测活化部分的MFI还是测整个直方图的MFI呢？

niwanmao

overcome1996 发表于 2021-12-6 16:28
@niwanmao 倪老师，如果用平均荧光强度的话，还需要做FMO对照吗？
是测活化部分的MFI还是测整个直方图的M ...

如果和其它抗体之间有比较明显的荧光补偿，则用FMO确定一下补偿。接着再对比各样本之间的MFI。

overcome1996

niwanmao 发表于 2021-12-6 17:01
如果和其它抗体之间有比较明显的荧光补偿，则用FMO确定一下补偿。接着再对比各样本之间的MFI。 ...

那就是说，如果没有明显的荧光补偿，也可以不做FMO，是吗？
各样本间的MFI是比较圈门后的阳性群吗(如果是阳性群，那这里又涉及到准确圈门，又需要FMO)，还是整个直方图呢？参考以前的贴子，貌似是需要正态分布(或近似正态分布)，也就是说整个直方图(活化＋非活化)。不知我理解的对不对

niwanmao

overcome1996 发表于 2021-12-6 17:25
那就是说，如果没有明显的荧光补偿，也可以不做FMO，是吗？
各样本间的MFI是比较圈门后的阳性群吗(如果是 ...

MFI不受直方图还是散点图的限制。只要圈中血小板这群即可分析。