流式细胞仪之散射光信号的检测

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一、散射光信号的检测

     在流式细胞仪中，从光的散射信号可得到非常有价值的数据，因为细胞对光的散射是细胞在未遭受任何破坏情况下固有的特性，所以可以用散射光信号对未染色的活细胞进行分析。细胞在液流中通过测量区时，经激光照射，细胞向球面空间所有方向发射光线，散射光信号与细胞的大小、形状、质膜和细胞内部的折射率有关。

  在流式细胞术中常用的有前向散射光和侧向散射光，前者也叫做小角度散射光，后者也叫做90°角散射光。如下图。

（一）  前向散射光

       前向散射光（FSC）亦成为小角度散射光或者0°角散射光，是激光检测区正向收集的小角度散射光，其波长与激光波长一致。一般来说，FSC的强度与细胞的大小体积有关。对同一细胞群体，散射光强的，其细胞大一些；散射光弱的，其细胞小一些。FSC除了与细胞大小有关，还受许多其他因素如细胞折射率等的影响，究竟两者更准确的关系是什么，因细胞不同、处理方法不同、固定方法不同而不同。因此，我们无法讲出更精确的结论，而是用FSC描述细胞体积时，可能会混淆概念，甚至可能会得到错误的结论。例如，当细胞不是球形时，如盘壮红细胞、扁平壮的精子时，由于细胞在液流中的空间取向不同，也可以导致对同型细胞检测得到的FSC信号完全不同，这是必须要注意的

FSC：激光器正前方1 -6度方向上有较强的衍射光，即前向散射光，FSC强度是d/λ的函数（ λ表示波长，d表示细胞大小），所以FSC反映被测细胞的体积大小和活力

（二）  侧向散射光

      侧向散射光（SSC）亦成为90°角散射光，收集到的是细胞通过测量区时90°方向的散射光，其波长与激光波长一直。SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，其强度与细胞内部的精细结构和颗粒性质有关。当然，SSC也与细胞的形状、大小有关，但这些是影响SSC信号的次要方面。如果一个细胞内部颗粒和细胞器较多，其SSC就越强。

SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化

      散射光的探测器可以是硅光二极管，也可以光电倍增管；前者多用于探测FSC，后者用于探测SSC。因为通过测量区的每个细胞不管它是否已被染色都能散射光线，所以光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样本中被染色的细胞和未染色的细胞。散射光信号最有效的用途，是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。使用FSC和SSC双参数测定，可以从不加任何染料的小鼠全骨髓中鉴别出若干个亚群。例如，流式细胞仪可根据广散射信号将人细胞分成三个亚群，即淋巴细胞、单核细胞核粒细胞。淋巴细胞FSC与SSC均小，单核细胞FSC大、SSC中等，而粒细胞FSC与SSC均大。如下图：

（三）  阈值设定

       由于流式细胞仪检测高度敏感，只要溶液中稍有杂质，就很容易产生微小的电压信号，因此，必须设定阈值（threshold）。所有细胞颗粒产生的信号必须高于此阈值才能被接收为信号，操作者一般通过FSC设定阈值来排除杂质、细胞碎片或者体积变小的死细胞。

     使用流式细胞仪时，我们会发现FSC时非常重要的信号，通常在FCM应用中，选取FSC做阈值，所有细胞颗粒产生的信号必须高于此阈值才能被接收为信号。当然，也可以使用其他参数做阈值，但是，操作者还是常用FSC来设定阈值，以排除样本中的各种碎片及鞘液中的小颗粒杂质，避免对被检测细胞的干扰。设定阈值是需要小心谨慎，以避免阈值过高，而漏掉了样本中信号较低的细胞的信息。如下图。

  

默认阈值	升高阈值后