类风湿关节炎不简单，罪魁祸首现原形

niwanmao

类风湿性关节炎发病率1％，B细胞产生自身抗体起着关键性作用，但究竟是谁诱导B细胞干这种坏事呢？Deepak A. Rao等人于2017年2月的Nature 上发表了一篇Letter《Pathologically expanded peripheral T helper cell subset drives B cells in rheumatoid arthritis》，帮我们找到了罪魁祸首：病理性辅助T细胞（TPH）。

这篇2017年2月发表的进展，可能个别公众大号发过，但都是直接翻译国外的新闻稿，毫无参考价值。流式就要有流式专业性的解读方式，所以我们从方法学和图形结果方面去读这篇文献。

文中，他们共检测了6例滑膜组织、9例滑膜液、14例外周血样本。

滑膜液和外周血
均采用Ficoll提取单个核细胞，然后冻存。集中起来批量标记检测和分析。

滑膜组织处理
取自废弃的关节成形组织，通过仔细解剖分离滑膜组织，切碎并用含100μg/ml LiberaseTL和100μg/mlDNA酶I的RPMI（Life Technologies）消化15分钟，每5分钟翻转一次。最后过滤、洗涤、进行红细胞裂解、冻存。集中批量标记检测和分析。

质谱流式细胞术
其中，3例滑膜组织、3例滑膜液、8例外周血样本采用质谱流式进行了检测，用37个标记（包含一个Live/dead），用eBioscience Transcription Factor Fix/Perm Buffer固定和破膜，接着以含1％BSA和0.3％皂素的PBS洗涤，最后标记胞内标记，以福尔马林固定。检测方案如下，外周血和滑膜液的方案略有不同：

  
常规流式细胞术和流式分选
管1：
anti-CD27- FITC (TB01)
anti-CXCR3-PE (CEW33D)
anti-CD4-PE-Cy7 (RPA-T4)
anti- ICOS-PerCP-Cy5.5 (ISA-3)
anti-CXCR5-BV421 (J252D4)
anti-CD45RA-BV510 (HI100)
anti-HLA-DR-BV605 (G46-6)
anti-CD49d-BV711 (9F10)
anti-PD-1- APC (EH12.2H7)
anti-CD3-AlexaFluor700 (HIT3A)
anti-CD29-APC-Cy7 (TS2/16)
propidium iodide.

其它方案：
anti-SLAM-AF488 (A12)
anti-SLAMF5-PE (CD84.1.21)
anti-SLAMF6-PE (NT-7)
anti-CCR2-PE (K036C2)
anti-CX3CR1-FITC (2A9-1)
anti-CD38-PE (HIT2)
anti-CD138-PE/Cy7 (MI15)
anti-CTLA-4-PerCP/Cy5.5 (L3D10)
anti-CCR5-FITC (2D7)
anti-FoxP3-AF647 (236A/E7)
anti-LAG-3-APC
anti-TIM-3-PE/Cy7 (F38-2E2)
anti-TIGIT-PE (MBSA43)

用BD FACSAria Fusion分选出T细胞，然后用美天旎磁珠进行分选出CD4＋T细胞，进行功能试验和RNA检测。

胞内因子染色
滑膜液标记anti-PD-1-PE/Dazzle 594、CXCR5-BV605、 CD4-BV650、PI，然后分选出CXCR5−PD-1hi、PD-1int、PD-1−三类CD4+ T，然后用anti-CD3/anti-CD28 beads刺激24小时（细胞：微球＝2：1），或用50ng/ml PMA和1ug/ml离子霉素刺激6小时。最后5小时加入Brefeldin A和Monensin（均为1：1000）。接着冰PBS洗涤两次，与Fixable Viability Dye eFluor 455UV 孵育30分钟，以含1％BSA的PBS洗涤，接着用eBioscience Transcription Factor Fix/Perm Buffer进行固定和破膜，再以含1％BSA和0.3％皂素的PBS洗涤，最后用anti-IL-21-APC (3A3-N2)、anti-IL-2-PE/Cy7 (MQ1-17H12)、anti-CXCL13-AlexaFluor700染色30分钟，洗涤、过滤后，在BD Fortessa上获取。

胞内转录因子染色
滑膜组织和滑膜液复苏后，PBS洗涤两次，与Fixable Viability Dye eFluor 455UV 孵育30分钟，以含1％BSA的PBS洗涤，标记表面标记anti-CD3-AF700、anti-CD4-BV650、anti-CCR2-PE、anti-CXCR5-BV421、anti-PD-1-PE/Dazzle 594  三十分钟，接着用eBioscience Transcription Factor Fix/Perm Buffer进行固定和破膜，再以含1％BSA和0.3％皂素的PBS洗涤，最后用anti-MAF-PerCP- eFluor710、anti-Bcl6-APC、anti-Blimp-1-AF488（均为1：20）标记4小时，洗涤、过滤后，在BD Fortessa上获取。
FoxP3和CTLA-4的染色步骤同上。

PCR和其它功能实验参见原文


结果
发现了一类PD-1high CXCR5－ CD4＋ T细胞明显增高，命名为TPH细胞。这些细胞尽管高表达PD-1，但并非耗竭型，反而表达辅助B细胞功能的因子（IL-21、CXCL13、ICOS、MAF）。与常见的PD-1high CXCR5－ 滤泡辅助T细胞相似，TPH细胞体外可通过分泌IL-21和SLAMF5诱导浆细胞分化，但两者之间还是存在较大不同，包括BCL6和BLIMP1以及一些诱导细胞至炎症部位的趋化因子（例如CCR2、CX3CR1和CCR5）。


滑膜组织总CD4＋T细胞viSNE分析结果，这个图可能很多FLOWER没见过，这种图是降维算法生成的图，相当于将30多个参数进行降维计算，最后投射到这个二维图，分成这样子，其中的颜色越红，表示表达该抗原表达量越高，越蓝，则越低。可见其中PD-1high 的细胞MHCII、ICOS、CD69均高表达，CD38中等、CXCR5－。


6例RA患者滑膜组织PD-1 high细胞比例



血清阴性和阳性的RA患者组滑膜液中PD-1high CD4＋ T细胞比例，血清阳性患者明显增高。        


血清阳性RA患者滑膜液、滑膜组织、扁桃体中PD-1high细胞细胞比例。
   

并可见滑膜液和滑膜组织中，PD-1high CXCR5－细胞明显高于PD-1high CXCR5＋细胞。


42例血清阳性RA患者、16例血清阴性RA患者、11例脊柱关节病患者、35例正常对照外周血记忆CD4＋T细胞中PD-1high CXCR5－细胞比例对比


RA患者治疗前后PD-1 hi CXCR5−T细胞、PD-1 hi CXCR5− MHCII＋ T细胞、浆母细胞比例变化，治疗后比例均降低，具有统计学差异。

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