多聚甲醛固定问题

seall

抗体表面染色后想第二天再检测，用多聚甲醛直接固定了，（染色后没有洗），结果发现加抗体的都是阳性，难道多聚甲醛使抗体都非特异结合到细胞上了？

niwanmao

1、染色后必须要洗涤先。
2、先洗涤后再用多聚甲醛固定10分钟以后，接着再用PBS充分洗涤去除多聚甲醛。
这两点必须要做到。

seall

嗯，明白了，没想到影响那么大

WJHUANG

好像多聚甲醛会导致很明显的非特异性结合，固定后背景会增加很明显，因此要固定时间不能太长，且必须洗去多聚甲醛

灬MIKI灬Love

WJHUANG 发表于 2019-8-28 10:07
好像多聚甲醛会导致很明显的非特异性结合，固定后背景会增加很明显，因此要固定时间不能太长，且必须洗去多 ...

你好，我的经验是（流式经验3年），sruface染色按照Protocol，染色后洗涤（buffer一般为satiningbuffer或者PBS可加0.1%BSA）最后500g，10min，4度，结束后弃上清，然后4%多聚甲醛（组织固定液）上机量（150-300ul）充分重悬，避光4度尽可能密封（时间久防止蒸发），3-7day内上机，包含特殊染色通道如欧联的那种PE-cy7，APCcy7等，尽可能3day内上机。个人觉得多聚甲醛并不存在加重染色的问题，愚见。

潘潘杰

niwanmao 发表于 2019-8-26 08:52
1、染色后必须要洗涤先。
2、先洗涤后再用多聚甲醛固定10分钟以后，接着再用PBS充分洗涤去除多聚甲醛。
这 ...

固定后，保存在pbs里暂存？老师

niwanmao

潘潘杰 发表于 2019-9-3 09:49
固定后，保存在pbs里暂存？老师

对。