使用针对同一靶标的不同单抗流式检测得到结果图的分析

dongfangyao

实验内容：在工具细胞293T中瞬转表达膜蛋白，并进行流式检测
实验结果：细胞膜蛋白表达阳性比例或者平均荧光强度随着质粒用量下降而下降。但发现一个现象：2种单克隆抗体结合后的阳性细胞表现不同：1抗体结合后的细胞群体松散，平均荧光强度达到8377(对照为97)；而2抗体结合的群体更紧密，平均荧光强度1216(对照为106) 。[实验中使用了2种单克隆抗体，1是直接偶联PE的；2是未标记抗体，实验中使用PE偶联的二抗进行检测]

想请教的问题：
1.我预计是2抗体结合的群体应更偏右，信号更强(因为二抗的放大效应)，但结果相反。可能的原因是什么？
2.两种抗体结合同种细胞后呈现的流式图差别大(松散程度)，可能的原因是什么...  

自己思考后总是纠结于一抗和二抗的用量问题，但又觉得这不是决定因素....，想请假下大家！

niwanmao

间标，理论上是有放大作用，但实际过程中，受到很多因素影响，导致染色效果不佳，这也是大多数实验还是建议有直标抗体，尽量用直标抗体的原因。

如果你能确保两种抗体的克隆号完全一致，那么只有前述的原因造成间标没做好。

Climber

个人认为：你的直标和间标不能这样对比，原则上能用直标就不用间标，实验操作自然是越简单越好。你的直标MFI很高且分布较广说明直标的的效果不错，至于间标为什么这么低（虽然集中但荧光值较低），可能的原因是某些间标使用时要严格避光，存放时间过长也可能导致荧光衰减。同时细胞的数量和抗体的比例要适当，细胞过量或抗体过量都可能影响实验结果。似乎间标方案（生物素+亲和素）时，一抗用的稀释比例较低，二抗稀释比例较高