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[流式protocol] PI检测细胞周期(乙醇固定,Triton X-100打孔)

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发表于 2012-2-13 16:02:25 | 显示全部楼层 |阅读模式

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I.     材料
    1、70% 乙醇,保存在– 20度
    2、DNA 染色液(10ml,新鲜配制)的组成:
           ①Triton–X 100   10uL
           ②1mg/ml碘化丙碇   200uL
           ③DNase-free RNase     2mg
           ④PBS      9.79ml
     注:1mg/ml的PI储存液是由1 mg PI溶于1 ml蒸馏水中配制而成,可在0℃到4℃保存数月。
            如果RNase不是DNase-free,可将2 mg RNase A在1 ml蒸馏水中煮沸5分钟。
II.      步骤
1.  取1x106 细胞/管,PBS洗涤两次,每次250g离心5分钟。
2.  尽可能完全去除上清,加入1ml于-20℃ 预冷的70%乙醇,注意,要边振荡边加
3.  标本保存于-20℃,直至要进行DNA染色(可保存数周至数月)
4.  染色当天取出标本,于250 x g 离心5分钟,尽可能完全去除上清,然后再用PBS洗涤1-2次,离心速度250g×5分钟。
5.   加入1 ml  DNA染液,充分振荡,染色15分钟即可上机检测。


以上是比较快速的步骤您也可以先用RNAse作用30分钟(常温或37度均可,但需注意有些细胞可能不适合,需对比测试),然后再用染色液孵育15分钟。
这几种作用方式结果无差别:http://www.flowcyto.cn/forum.php ... &pid=4794&fromuid=1


如果您的细胞经过GFP或EGFP转染,此protocol不适合,请移步至另一个方法:http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=1331


发表于 2013-7-17 10:23:59 | 显示全部楼层

其实纠结前后加主要是发现细胞会碎,说白了就是状态不好。要避免这种情况(主要是贴壁细胞),在消化完细胞以后,离心去上清,用离心管+完全培养基重悬细胞,在孵箱里面孵育15-20分钟——我称为“复性”,然后再离心去上清用酒精固定,会减小细胞破碎的几率。加入的方法我推荐是重悬以后快速加入酒精(酒精浓度迅速达到70-75%)。加入酒精尽可能少用抢头吹打,如果要吹打可以把枪头剪短一截(增加截面积,减小压强),另外注意次数和力度,很多情况下是这一步把细胞搞碎的。

另外最好不要用PBS重悬,还有不要用PBS配酒精。重悬就倒上清的时候剩点培养基就好,主要目的是让每个细胞都是呈单细胞状态。配70-75%酒精一定要用纯水,PBS会有盐析出,对细胞会有机械损伤。

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参与人数 1流星 +1 收起 理由
niwanmao + 1 很好的经验之谈!

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发表于 2017-9-22 18:16:53 | 显示全部楼层
didi_zhou 发表于 2013-7-17 10:23
其实纠结前后加主要是发现细胞会碎,说白了就是状态不好。要避免这种情况(主要是贴壁细胞),在消化完细 ...

我的办法是先用1毫升dd水吹匀细胞,然后加3ml93%乙醇混匀,放置﹣20过夜,效果不错,没有什么粘连,破膜效果也好
 楼主| 发表于 2012-4-5 20:59:24 | 显示全部楼层
蓝白小熊 发表于 2012-4-5 19:15
感谢老师的详细步骤,不过我想问一下,我平时做周期,孵育了RNase之后就直接加PI,没有加Triton X-100,可 ...

需要加triton X-100,这是用来打孔的。如果没有这个,PI大部分染的都是死细胞,而正常细胞对PI的通透性很低。
发表于 2012-2-13 16:36:09 | 显示全部楼层
非常感谢倪老师的指点!老师说的对,作为专业性论坛,标准化操作指南的建设能给大家很多有益的帮助,支持老师的工作!
发表于 2012-2-14 08:58:11 | 显示全部楼层
请问:加冰乙醇放4℃和放-20℃保存有差别吗?
 楼主| 发表于 2012-2-14 09:30:04 | 显示全部楼层
jingweis530 发表于 2012-2-14 08:58
请问:加冰乙醇放4℃和放-20℃保存有差别吗?

您是指加完冰乙醇之后,标本的存放温度?还是指加入的冰乙醇预冷的温度?
发表于 2012-2-15 08:33:36 | 显示全部楼层
标本存放温度
 楼主| 发表于 2012-2-15 09:00:19 | 显示全部楼层
jingweis530 发表于 2012-2-15 08:33
标本存放温度

标本存放-20℃保存时间长。如果你短期保存,两者差别不大。
发表于 2012-2-15 09:42:46 | 显示全部楼层
明白了,谢谢!
发表于 2012-2-17 14:47:39 | 显示全部楼层
哈哈 ,不错啊 ,我也把这个项目开起来 感谢各位
发表于 2012-2-20 16:05:44 | 显示全部楼层
倪老师,测周期是PI的浓度是多少合适?
 楼主| 发表于 2012-2-20 17:14:25 | 显示全部楼层
叶绿素 发表于 2012-2-20 16:05
倪老师,测周期是PI的浓度是多少合适?

我这边平时都是用这个protocol,折算下来浓度大概是20ug/ml,效果还可以。但国外另一个Protocol中写的40ug/ml。
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