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[流式protocol] 用PI检测GFP转染细胞的细胞周期(PFA和乙醇固定)

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发表于 2012-2-16 09:07:46 | 显示全部楼层 |阅读模式
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1、检测原理
为了使PI染色能够取得更好的效果,细胞通常需要用乙醇破膜,以使PI能够进入到核内。然而,用乙醇处理后,容易导致胞内可溶性的GFP在破膜后漏出,从而使GFP荧光降低或缺失。用固定剂(如多聚甲醛)虽然可以保留住细胞内的GFP,但是容易导致G0/G1峰的CV系数过大。
本方法通过固定/破膜同时检测GFP表达和DNA含量。首先细胞用1%多聚甲醛固定,然后以70%乙醇破膜,最后用含RNAse的PI染液染色。

2、标本
GFP转染的细胞

3、材料和试剂
• 5ml Falcon polypropylene Round-Bottom流式管 (12x75 mm)
• 冷却型离心机
• 37°C 水浴
• 40 μm尼龙滤膜 (BD Falcon Cell Strainer # 352340) or 70 μm 尼龙滤膜
• 无菌过滤的磷酸盐缓冲液(PBS), 4°C
• 固定液 (4°C): 将2g高纯度多聚甲醛 (电镜级,Polysciences, 终浓度2% w/v)加入到100 ml PBS中。在通风橱中加热至70°C,直至多聚甲醛完全溶解(约1小时)。冷却至室温,调节pH值至7.2。避光保存在2°C-8°C。该溶液至少可稳定保存1个月,请定期检测pH值。
• 70%乙醇, -20°C
• 碘化丙啶(PI)溶液:
储存液:将1 mg PI (Sigma, P 4170)加至 1 ml dH2O,配成1 mg/ml的储存液。分成小管保存在-20°C,可保存2年。如果需要频繁使用,可避光保存在4℃,可保存2个月。如果PI溶液在室温中放置超过48小时,或颜色变成暗红色,则需要抛弃掉。一定要记住避光。
工作液::将PI储存液用PBS以1:25的比例进行稀释,PI的终浓度为40 μg/ml.(原文中似乎未提及RNAse,可能老外忘了写,工作液的配制建议按照这个帖子配制:http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=1330
• RNAse A溶液:
将50 mg RNAse A (Sigma, R-4875)加至 50 ml PBS中,加入Tween-20,调节其浓度至0.1%。将溶液置于95℃水液30分钟。然后置于冰上1小时,通过0.2μm滤器过滤掉沉淀。溶液可在4℃保存6个月,或分成小管保存在-20°C.

4.对照
• GFP转染的细胞,不加PI
• 未转染GFP,未加药的细胞,加PI

5.步骤

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发表于 2018-5-7 08:38:30 | 显示全部楼层
yanwei 发表于 2018-5-5 08:59
老师您好,最近做转染病毒后的细胞带绿色荧光,用的PI染色做细胞周期,给我们做的老师说这样效果不好,以前 ...

我们的经验是用0.5%多聚甲醛预固定,洗涤后再改用70%乙醇固定。这样既不会造成GFP的丢失,对周期的影响也最小。供参考
 楼主| 发表于 2016-3-24 19:58:28 | 显示全部楼层
wulaer110 发表于 2016-3-24 14:14
老师,您好!请问此方法适合PI单染测凋亡(亚二倍体峰)吗?谢谢

可以的。
发表于 2012-2-17 11:49:37 | 显示全部楼层
倪老师,我之前说的37度水浴后细胞结团的情况是在仅仅加入RNase酶溶液处理细胞这一步时,细胞发生结团了,以至于接下来用PI染液无法进行细胞的染色上机检测。我想如果直接配制好您之前给的那个含RNase酶的PI染液处理细胞,这样就是边降解RNA,边PI染色,此时37度水浴溶液还不清楚效果如何,有待做试验后验证,我看了Current Protocols in Cytometry中的步骤,其中没有用RNase酶处理的步骤,这一点有疑问?!明明材料中有RNase溶液的,步骤中没用到....老外写书也不严谨啊,呵呵
 楼主| 发表于 2012-2-17 11:55:09 | 显示全部楼层


嗯。你看的很仔细,的确,PI的工作液还是按照这个帖子的方法配制吧:http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=1330

期待你的验证结果,希望你能把标本分成两份,分别用常温、37度水浴处理,其它步骤一样,然后把数据文件发上来大家看看:)
发表于 2012-2-17 12:03:04 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2012-2-17 11:55
嗯。你看的很仔细,的确,PI的工作液还是按照这个帖子的方法配制吧:http://www.flowcyto.cn/forum.php?m ...

嗯,好的!等有结果了,会上传的 。
 楼主| 发表于 2012-2-24 12:35:19 | 显示全部楼层
最近有研究生做细胞周期,让他们测试了一下:
1、先加RNAse,37度水浴30分钟,然后取出,加入PI染液15分钟。
2、RNAse和PI的处理均在常温下进行。
3、按照http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=1330的方法,RNAse和PI配成工作液,直接加入至细胞中,常温孵育15分钟。

发现三种方法的结果都很好,没出现成团现象,这说明以上三种方式都是可行的。可能vetzcm站友的37度孵育时细胞成团现象跟细胞种类有关,建议可以改用常温,不会影响结果的。
发表于 2014-5-16 15:42:41 | 显示全部楼层
我最近也在做细胞周期
发表于 2014-5-28 09:34:56 | 显示全部楼层
后天第一次做细胞周期,忐忑中
发表于 2014-5-30 15:41:14 | 显示全部楼层
第一次做细胞生长周期,发现250*g或者300*g离心根本就看不到细胞,然后把离心率加到1500rpm,但是发现流式检测的时候,细胞的面积差距很大,这是什么原因呢
 楼主| 发表于 2014-5-30 19:45:55 | 显示全部楼层
lindsaylee 发表于 2014-5-30 15:41
第一次做细胞生长周期,发现250*g或者300*g离心根本就看不到细胞,然后把离心率加到1500rpm,但是发现流式 ...

一般都是1500转。你所说的细胞面积差距很大是什么意思,是指PI-A拖的很长?只要选前面那一段即可,后面细长的不用管,可能是粘连造成的。
发表于 2014-6-6 16:18:50 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2014-5-30 19:45
一般都是1500转。你所说的细胞面积差距很大是什么意思,是指PI-A拖的很长?只要选前面那一段即可,后面细 ...

看到这个生长周期流式的结果,我很囧,不知道什么原因,第一次做,毫无经验
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