流式细胞术的样本制备和实验设计

niwanmao · 发表于 2015-4-17 11:11:43

『流式中文网』翻译并总结
视频讲座讲解了4个方面的内容：

1. 细胞来源和细胞悬液制备
2. 标本处理
3. 对照的设置以及使信号最大化
4. 如何选择和使用抗体

一、细胞来源和细胞悬液制备

全血标本：
1. 选择抗凝剂时要注意你要检测的抗原是否受抗凝剂中的组分影响？例如一些CD41抗体对EDTA非常敏感。
2. 裂解液的选择，可选择自配的氯化铵裂解液（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-178-1-1.html）或者商业化含固定成份的裂解液，但是要需要注意个别抗体可能会受裂解液中某种组分影响。大多数裂解液对所有种类的红细胞均有用，但某些病理性疾病标本或禽流感标本中有核红细胞可能很难裂解。
3. 血浆中是否存在干扰性物质。最典型的例子就是标记B细胞表面的免疫球蛋白，由于血浆中的Ig会影响抗体结合，所以需要事先用大体积的缓冲液洗涤至少3次。

PBMC：
全血标本用Ficoll密度梯度离心后提取出来的单个核细胞，包含淋巴细胞、单核细胞，可用于培养或直接分析。
缺点就是可能会丢失其中某些稀有细胞。

细胞株：
尽管细胞可能会处于不同周期，但细胞群比较同质。

从实体组织制备细胞悬液：
典型的标本是淋巴结、脾脏、肝脏等。
利用物理方法或者酶消化法（如胶原酶）制备。但是酶可能会破坏细胞表面抗原表达。
需要注意的是组织中有些细胞可能不能有效解离出来，例如免疫组化方法可发现脾脏中存在许多F4/80+的巨噬细胞，但在流式中很少看到。

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niwanmao · 发表于 2023-11-23 13:50:08

shupian 发表于 2023-11-23 10:59
您好，倪老师，想请教您一下，我们做人肺和肺的引流淋巴结的单细胞，结果做出来是全黑的，太多的碳末和粉尘 ...

我们10年前遇到一个有点类似的山羊葡萄球菌感染的患者样本，可能有点像你所说的情形：
一例九年一遇的奇特标本
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2289-1-1.html
(出处: 流式中文网)

不过，我们当时只是单纯过滤，上机检测没有什么干扰。如果像你这里干扰比较大的话，可考虑Ficoll提取一下看看，可能能够纯化

shupian · 发表于 2023-11-23 10:59:04

您好，倪老师，想请教您一下，我们做人肺和肺的引流淋巴结的单细胞，结果做出来是全黑的，太多的碳末和粉尘干扰，上机检测也没有群体，这种样本怎么处理才能完全解决碳末的干扰。

lgfffancy · 发表于 2017-5-23 22:05:39

需要购买吗

niwanmao · 发表于 2017-4-18 08:16:09

丑小鸭小白发表于 2017-4-18 00:48
看不到视频，老师。

先用2颗流星购买，然后就可以看到底部的视频了。

丑小鸭小白 · 发表于 2017-4-18 00:48:17

看不到视频，老师。

sunny2829 · 发表于 2016-11-23 09:20:39

谢谢楼主

xbaizxyq · 发表于 2016-11-16 11:04:09

niwanmao 发表于 2016-11-16 09:46
涉及到轻链和免疫球蛋白的标记，先大体积洗涤三次，然后标记抗体，最后裂解红细胞，去上清。 ...

明白了。谢谢倪老师~

niwanmao · 发表于 2016-11-16 09:46:50

xbaizxyq 发表于 2016-11-16 09:23
倪老师，如果要标记同时标记血液中的B细胞和T细胞，是先加抗体后裂红还是先裂红再加抗体呢 ...

涉及到轻链和免疫球蛋白的标记，先大体积洗涤三次，然后标记抗体，最后裂解红细胞，去上清。

xbaizxyq · 发表于 2016-11-16 09:23:40

niwanmao 发表于 2016-9-8 08:08
在抗体标记之前。

倪老师，如果要标记同时标记血液中的B细胞和T细胞，是先加抗体后裂红还是先裂红再加抗体呢

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niwanmao niwanmao 当前离线积分 34323	发表于 2015-4-17 11:11:43 \| 显示全部楼层 \|阅读模式『流式中文网』翻译并总结视频讲座讲解了4个方面的内容： 1. 细胞来源和细胞悬液制备 2. 标本处理 3. 对照的设置以及使信号最大化 4. 如何选择和使用抗体一、细胞来源和细胞悬液制备全血标本： 1. 选择抗凝剂时要注意你要检测的抗原是否受抗凝剂中的组分影响？例如一些CD41抗体对EDTA非常敏感。 2. 裂解液的选择，可选择自配的氯化铵裂解液（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-178-1-1.html）或者商业化含固定成份的裂解液，但是要需要注意个别抗体可能会受裂解液中某种组分影响。大多数裂解液对所有种类的红细胞均有用，但某些病理性疾病标本或禽流感标本中有核红细胞可能很难裂解。 3. 血浆中是否存在干扰性物质。最典型的例子就是标记B细胞表面的免疫球蛋白，由于血浆中的Ig会影响抗体结合，所以需要事先用大体积的缓冲液洗涤至少3次。 PBMC：全血标本用Ficoll密度梯度离心后提取出来的单个核细胞，包含淋巴细胞、单核细胞，可用于培养或直接分析。缺点就是可能会丢失其中某些稀有细胞。细胞株：尽管细胞可能会处于不同周期，但细胞群比较同质。从实体组织制备细胞悬液：典型的标本是淋巴结、脾脏、肝脏等。利用物理方法或者酶消化法（如胶原酶）制备。但是酶可能会破坏细胞表面抗原表达。需要注意的是组织中有些细胞可能不能有效解离出来，例如免疫组化方法可发现脾脏中存在许多F4/80+的巨噬细胞，但在流式中很少看到。购买主题已有 349 人购买本主题需向作者支付 2 流星才能浏览
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