正常小鼠脾脏Th1/2/17流式细胞术问题请教！

zhuangrui911

实验步骤：
步骤1、取小鼠脾脏,100um滤网,注射器内芯研磨,PBS液(含2%FBS+2mM EDTA）冲洗研磨碎屑至50ml离心管,离心350g,5min,弃上清。
步骤2、加入1x红细胞裂解液裂解3ml(每脾脏/3ml,1x红细胞裂解液,用DI水稀释),裂解5min后(冰上),加入等体积PBS液(含2%FBS+2mM EDTA),离心350g,5min,弃上清。若上清液“显红色”，可重复一遍。
步骤3、3ml 1640(含10%FBS+1%P.S)重悬至中号培养皿,加入 PMA（终浓度50ng/ml）,Ionomycin（终浓度1ug/ml）,BFA（5ug/ml）（PMA、Ionomycin、BFA均从碧云天购买）37℃孵箱孵育4小时后,离心350g,5min,弃上清,加入PBS液(含2%FBS+2mM EDTA)吹打,离心同前,弃上清。
步骤4、 PBS液(含2%FBS+2mM EDTA)重悬,计数,母液细胞浓度1-2x10^7cells/ml,吸100ul至流式管,即1-2x10^6cells/tube.
步骤5、共8管：

• Th1，CD4+IFN
• Th2，CD4+IL4
• Th17，CD4+IL17A
• 空白对照
• CD4单阳
• IFN单阳
• IL17单阳
• IL4单阳
  

步骤6、CD4抗体1ul,避光,4°孵育30min。


步骤7、加入PBS液(含2%FBS+2mM EDTA)吹打,离心350g,5min,弃上清。1遍。
步骤8、eBioscience 的Fixation/Permeabilization concentrate：Fixation/Permeabilization Diluent=1:3混合，1ml/tube，避光4°30min。（这个是Foxp3 kit，但实验室的人和试剂公司的技术都说可以用来破细胞膜）
步骤9、不离心，直接加入Permeabilization Buffer 1x，震荡，离心350g,5min,弃上清。
步骤10、100ul Permeabilization Buffer重悬，每管加入对应抗体(抗体均为biolegend)，避光，室温，60min：

• IFN _2ul
• IL4 _5ul
• IL17 _1ul
• 空
• 空
• IFN _2ul
• IL17 _1ul
• IL4 _5ul
  

步骤11、每管加2ml Permeabilization Buffer震荡，离心350g,5min,弃上清。
步骤12、300ul 1%多聚甲醛重悬，上机。
以上为我目前的实验步骤，重复过3遍，但每次Th1/17，只有2.x%，Th2，只有1%左右。
问题：
1，请问有可能是哪一步或哪几布除了问题？
2，正常小鼠脾脏Th1/2/17/Treg比例应该是多少？
3，Sigma的PMA、Ionomycin、BFA官网显示无库存无报价，咨询后邮件回复现在无法进入国内了。那么有没有哪个厂家的可以替代，效果比较好？
谢谢！

zhuangrui911

顶一顶，别沉，重复了3遍没出结果。

niwanmao

1、光看步骤没用，实际上会有不少细节影响结果，你要么这样，先把图放一两幅看看分群如何。

2、正常小鼠脾脏的Th1/Th2/Th17/Treg比例可以参考一些相关文献，但是肯定不会有公认的参考范围。

3、Sigma的这三样产品，我觉得应该国内不少代理商都会有现货吧，你可以各种代理商都问问，Sigma的产品代理还是挺多的，你自己从官网肯定很难订。

Victorrwang

zhuangrui911 发表于 2016-6-21 16:43
顶一顶，别沉，重复了3遍没出结果。

正常老鼠的脾脏，除了INF-gamma+ CD4 T，其他的细胞比较罕见。这些老鼠都养在实验室，理论上说，绝大部分T细胞应该是naive T。

不是很明白你这个实验的目的是什么。。 一般做这种ex vivo的检测，看的都是疾病模型下的老鼠，如：癌症模型，自身免疫疾病模型

zhuangrui911

Victorrwang 发表于 2016-6-23 04:47
正常老鼠的脾脏，除了INF-gamma+ CD4 T，其他的细胞比较罕见。这些老鼠都养在实验室，理论上说，绝大部分 ...

我先做正常老鼠的，看看比例是多少，熟悉这个过程。

zhuangrui911

niwanmao 发表于 2016-6-21 20:24
1、光看步骤没用，实际上会有不少细节影响结果，你要么这样，先把图放一两幅看看分群如何。

2、正常小鼠脾 ...

小鼠脾脏淋巴细胞CD4单阳管

这是其中一次Th1 2 17 Treg，CD4单阳管的情况，为何CD4的阳性率都这么低？（圈了淋巴细胞，用直方图横坐标为CD4的直方图，是CD4单阳率低的意思吗？）

niwanmao

zhuangrui911 发表于 2016-6-25 16:58
这是其中一次Th1 2 17 Treg，CD4单阳管的情况，为何CD4的阳性率都这么低？（圈了淋巴细胞，用直方图横坐 ...

从FSC/SSC散点图看，感觉你的FSC和SSC都是用Log模式，不知道为什么要用Log？
其次，因为是组织，所以在淋巴细胞区域及其附近不排除会有一些组织细胞或碎片混杂，如果要纯的T细胞，最好用CD3设门。