细胞周期做出来这样的图，可能的原因是什么呢？

会飞的鱼5858

•测定酵母细胞周期，试验结果重复很多次都不好，G1峰和G2峰连在一起，下面是主要操作步骤 收细胞：将 酵母细胞样品（约1*106个细胞）以 2000rpm，5 min 的离心条件收集细胞，去掉培养基。用 1 mL 的PBS悬起细胞，以 2000rpm，5min 的离心条件收集细胞，小心吸除上 固定：70%乙醇4℃固定过夜（加入300微升PBS，缓慢加入 700微升 的预冷乙醇（-20℃预冷）溶液悬起细胞，4固定12-24小时 12000rpm 左右离心20分钟(离心力和时间减少的话总感觉没有完全离下去，吸取上清还是会有漂浮的细胞浊)，沉淀细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞。再次离心 沉淀细胞。 染色：每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液（0.5ml染色缓冲液+25μl碘化丙啶染色液(20X)+10μlRNase A (50X)），缓慢并充分重悬细胞沉淀， 37ºC避光温浴30分钟。冰浴避光存放，1小时内测定。 下面是做出来的图，流式操作应该没有问题，都是很有经验的专业老师测定的。 请教各位老师，为什么每次做出来都是G1G2峰连着的？结果不好，一直找不到解决办法

sunzheng_99

1)        %CV，指的是G0/G1期峰的CV值，最好<8%，对于实体组织来说，这个标准比较难达到，但应该尽可能达到，CV值过大，不仅直接影响到S期所占比率的计算，还会给倍体的分析带来困难，因为有可能会掩藏了一个不正常的峰
2)        Cell#，指的是用于拟合分析的细胞数，不能少于10000个
3)        RCS，是一个统计学上的指标，用来反应你所选择的这个模式与你的标本的拟合程度，0.9-3.0为比较好的一个范围，而3.0-5.0为可以接受，小于0.8或是大于5.0，都被视为不可接受
4)        %B.A.D，指的是背景中的碎片和聚集体所占的比率，需小于20%
5)        软件还用不同的颜色来代表这些指标的好坏，绿色代表好，黄色代表还可以，红色代表很差或不正常
6)        若你激活了S期评估这项功能，软件在Diags中还会相应地进行二倍体，异倍体和总的S期的错误分析，分别计算它们的标准偏差。

sunzheng_99

1   你的样本处理还要优化 ，数值在范围内就行2  通过设门去除粘连细胞

会飞的鱼5858

sunzheng_99 发表于 2019-4-30 14:58
1   你的样本处理还要优化 ，数值在范围内就行2  通过设门去除粘连细胞

非常感谢您的回复，样本处理优化的话，您有什么建议嘛？会不会与收细胞时的离心力有关系？或者与试剂有关，没染好？细胞数目过多？求大神赐教

会飞的鱼5858

@ niwanmao
老师，可否指点一二？多谢啦

niwanmao

会飞的鱼5858 发表于 2019-5-8 19:11
@ niwanmao
老师，可否指点一二？多谢啦

图形其实还是有的，可能关键还在固定那一步，你300ul悬液，最后加700ul 70％乙醇，感觉体积太小，可能固定效果不太好，试着加3ml看看。