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OMIP-057:14色方案确定小鼠γδT细胞的7个发育阶段

发布者: niwanmao | 发布时间: 2019-7-8 21:28| 查看数: 301| 评论数: 0|帖子模式

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与常规T细胞不同,许多表达TCRγδ的T细胞(γδT细胞)在胸腺发育期间就分化出效应功能。
γδT细胞效应亚群可以根据它们产生细胞因子的能力主要分为三个亚群:
  • IL-17(γδT17)
  • IFN-γ(γδT1)
  • IL-4和IFN-γ(γδNKT)
不过也有一部分γδT细胞从胸腺中输出时为初始细胞(γδTn),需要在外周分化,并建立与常规适应性T细胞相似的长效TCR依赖性记忆。
在成年小鼠中,γδT细胞的效应亚型主要是γδTn细胞、产生IFN-γ的γδT1、γδNKT细胞,其中大多数是TCRVγ1.1或TCRVγ2片段。
使用CD24(HSA)、CD25(IL-2Ra)、CD73(Nt5e)、CD117(c-Kit) 、CD200(OX-2)、CD371(Clec12a)可将γδT细胞的发育可分为7个阶段(命名为A至G),在TCRVγ1.1+和TCRVγ2+中均存在。
20190708_205001.png

γδT细胞占胸腺细胞总数的0.5%以下。因此,对胸腺γδT细胞亚群的研究需要获取和分析大量细胞事件,实验设计也要严谨。
丹麦的Terkild Brink Buus等人针对小鼠γδT设计了一个14色方案《OMIP-057: Mouse γδ T-Cell Development Characterized by a 14 Color Flow Cytometry Panel》可以同时在TCRVγ1.1+亚群、TCRVγ2+亚群和总γδT细胞群分析七个发育阶段以及效应细胞相关的表面标志物。方案里面的抗体只需表面染色,无需固定和破膜。如果有条件,也可以事先磁珠富集CD4/CD8双阴性(DN)细胞,但是DN富集可能会去除共表达低水平CD4或CD8的少量γδT细胞,因此,如果对于γδT细胞亚群非常关注的研究,要么不做DN富集,要么采用LS柱以保留低CD4或CD8表达的细胞。

方案
这个方案需要说明一下的是,PE通道的预留通道,用于筛选一些效应或功能分子,如果不需要做进一步的效应分子或功能分子筛选,那么可以把CD117 APC-R700换为CD117 PE,可以使CD117分群更好:
20190708_205625.png

设门和分析
设门开始几步仍然如以前一样,依次排除碎片(圈淋巴区域)、排除粘连体、排除PI+死细胞,接着圈CD4-CD8-的DNT区域
20190708_205846.png
在DNT中,通过TCRδ+CD3+即为总γδT,并可根据TCR表达分为TCRVγ1.1+亚群、TCRVγ2+亚群。这三个群体,依次设门分出7个发育阶段:
  • γδT根据CD73/CD25分出CD25+的A阶段
  • 排除A之后剩余γδT细胞根据CD73/CD371分出CD371+的B阶段
  • 排除B之后剩余γδT细胞根据CD73/CD200分出CD73-CD200-的C阶段和CD73-CD200+的D阶段
  • 排除掉C和D之后剩余γδT细胞根据CD117/CD200分出CD117+CD200+的E阶段
  • 排除掉E之后剩余γδT细胞根据CD200/CD24分为双阳性的F阶段和双阴性的G阶段。
20190708_205902.png

如果需要进一步筛选各亚群效应相关功能分子,则可依次在PE中采用CD5、CD27、CD44、CD45RB、CD62L、CD122、CD127、NK1.1、Ly-6C:
20190708_210214.png

这管14色,应该来说多数做科研的地方都能做,赶紧收藏吧!


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