PMG系列8：人PBMC Phosflow操作流程

niwanmao

这里介绍的是Pharmingen第8个系列中文操作流程：人外周血单个核细胞BD Phosflow操作流程。该流程中包含了4个方法：Detergent method（方法1）、Mild or harsh alcohol method（方法2和3）、Harsh Detergent Method（方法4）。

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不大自在啊

老师您好，我在做磷酸化流式的时候遇到一些问题，烦请您指教。我做的是TCR通路的磷酸化，ficoll法分离PBMCs，用纯化的CD3 1ug/ML CD28 2ug/ML刺激15min，37℃。染的是PKC-γ1 PE、zap70 percp-cy5.5、SHP2 PE、Src PE（分为4管单染），用相同处理方法的细胞做空白对照，分别试了方案1和方案2，结果没有一管出阳性.请问这种情况是哪里可能出问题呢。查了之前您上传的文献《Single-Cell Phospho-Protein Analysis UNIT 8.17 by Flow Cytometry》里面ZAP70用的是IgM+H2O2刺激的。是不能用CD3+CD28刺激呢？抑或刺激的量与方法不对？

lisa-apple

倪老师，请问测之前，细胞需要加磷酸化酶抑制剂处理吗？如果需要的话，您有推荐的加入量，孵育时间吗？

niwanmao

lisa-apple 发表于 2017-6-4 11:47
倪老师，请问测之前，细胞需要加磷酸化酶抑制剂处理吗？如果需要的话，您有推荐的加入量，孵育时间吗？ ...

一般去掉刺激因素并且固定之后，就可以了。
如果你做出来结果不理想，可以考虑试试，但我觉得挺难的，因为磷酸化酶并非只有几种。

lisa-apple

niwanmao 发表于 2017-6-4 12:42
一般去掉刺激因素并且固定之后，就可以了。
如果你做出来结果不理想，可以考虑试试，但我觉得挺难的，因 ...

好的 谢谢您