BDaria2分选Treg细胞

lin850424

用BD aria2的机子做了几次分选人的单个核细胞中的CD4+CD25+的细胞，用到以下几个问题，与大家一块探讨一下：
1.每次提取5ml的人的血液，用Ficoll分离液分离出单个核细胞，国产的，里面不可避免的还有红细胞和血小板等不是单个核细胞的events，有好办法去除吗？
2.加CD4 CD25荧光抗体，分析出双阳性细胞
3.分选时，如果仅用一个流式管，每秒events非常多，可以达到40000个左右吧，flowrate已经调到1了，而且效率低，纯度也差。
4.那就增加稀释倍数，如果稀释到4倍，每秒events下降很多，同时效率明显回升，细胞得率也还可以，但也太慢了，5ml血的单个核细胞要分离一个上午不成？我可是大量的血等着分呢。
不知道做过aria2分选CD4CD25细胞的同仁们有什么见解！

niwanmao

第1个问题很简单啊，用CD4＋设门不就行了？

第2、3、4分选的问题，还得请分选方面的高手出马 @gcz5340  

lin850424

niwanmao 发表于 2014-2-22 23:17
第1个问题很简单啊，用CD4＋设门不就行了？

第2、3、4分选的问题，还得请分选方面的高手出马 @gcz5340   ...

我的意思是第一步如果有许多红细胞和血小板会增加每秒events数目，可能会降低细胞分选效率吧。设门解决不了这个问题吧。

niwanmao

lin850424 发表于 2014-2-22 23:22
我的意思是第一步如果有许多红细胞和血小板会增加每秒events数目，可能会降低细胞分选效率吧。设门解决不 ...

可以通过设置阈值排除，Aria2似乎用的应该也是diva软件，diva软件调节电压的那个面板有一个选项卡是调节threshold的，把FSC调大一些就可以了。

dragonhzqsmmu

是否可以考虑在流式细胞分选前加一步磁珠分选CD4阳性细胞，这样可以避免RBC、PLT的干扰，而且分选的纯度和效率能得到保证，唯一的缺点就是费用会上去

Yangsw

Ficoll分离出单个核细胞后，细胞沉淀加约2ml溶血剂悬浮，作用2分钟后离心，PBS洗涤可去除RBC。细胞沉淀加10mlPBS悬浮，800转/分低速离心5分钟可去除大部分PLT。我是这样处理，可以试一下。

lin850424

dragonhzqsmmu 发表于 2014-2-24 13:53
是否可以考虑在流式细胞分选前加一步磁珠分选CD4阳性细胞，这样可以避免RBC、PLT的干扰，而且分选的纯度和 ...

对啊，一个LS的柱子得需要150块钱吧，太浪费了吧

lin850424

Yangsw 发表于 2014-2-24 14:58
Ficoll分离出单个核细胞后，细胞沉淀加约2ml溶血剂悬浮，作用2分钟后离心，PBS洗涤可去除RBC。细胞沉淀加10 ...

好的，我试试看啊，谢谢

lin850424

Yangsw 发表于 2014-2-24 14:58
Ficoll分离出单个核细胞后，细胞沉淀加约2ml溶血剂悬浮，作用2分钟后离心，PBS洗涤可去除RBC。细胞沉淀加10 ...

溶血剂和裂解液是一回事吗？哪个厂家有卖？

niwanmao

lin850424 发表于 2014-2-24 18:31
溶血剂和裂解液是一回事吗？哪个厂家有卖？

一样的，可以自己配制氯化铵裂解液：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-206-1-1.html