Treg检测

ybz

   有没有人用BD公司的 FOXP3 kit  (货号560098)来检测Treg细胞的，固定破膜效果如何？为什么我的检测不出来呢？需要注意什么？

niwanmao

你使用的是哪个公司的破膜剂？处理步骤怎么样？

susu

我们常用的是eBioscience公司的FOXP3试剂盒，小鼠和人的Kit我们都用过，按照说明书操作结果一直都很好。BD的我们没用过，不过从你的结果图上看，你的CD25表达非常低，是不是考虑下标本的原因？如果CD25表达比例都这么少的话FoxP3+的细胞数估计也很少，你总数设置收集多少？一般我们是按G2门内收集1W的细胞，但如果看到CD25比例比较低的情况下会增加门内细胞到3-5W，以获取更多的细胞。

ybz

niwanmao 发表于 2014-3-19 18:49
你使用的是哪个公司的破膜剂？处理步骤怎么样？

BD公司的，步骤是  1.外周血单个核提取，调整细胞数2*10^6，取100ul 细胞悬液，加入CD4 .CD25抗体，避光孵育30min,洗涤、弃上清 。 .2.加入2ml buffer A 避光孵育10min,离心、弃上清。2.加入0.5ml buffer c, 避光孵育30min,离心、弃上清.   3.加FOXP3抗体

ybz

susu 发表于 2014-3-20 15:40
我们常用的是eBioscience公司的FOXP3试剂盒，小鼠和人的Kit我们都用过，按照说明书操作结果一直都很好。BD ...

我也是按照说明书来操作的，不明白为什么单个核提取细胞的时候淋巴细胞比例只有30%~50%？我们实验室上机的时候都不给按设门获取细胞的，只按总数来得细胞，所以有点被动。为什么CD25也这么难标上，它不是表面抗原来的吗？

niwanmao

ybz 发表于 2014-3-21 12:16
我也是按照说明书来操作的，不明白为什么单个核提取细胞的时候淋巴细胞比例只有30%~50%？我们实验室上机 ...

这个kit中的Buffer A和C你是不是都已经按照说明稀释了？

1. Dilute FoxP3 Buffer A (10X concentrate) 1:10 with room temperature (20°C to 25°C) deionized water.

2. To make a working solution of Buffer C, dilute FoxP3 Buffer B (50X) into 1X FoxP3 Buffer A at a ratio of 1:50 (Buffer B:Buffer A)

watson77

G2门是不是圈的有点问题？圈的是CD4+群，不是CD4+CD25+群，因此G3实际为Treg/CD4+T，当然比例低了。而且从G2上看，CD25阳性群似乎比较少。

niwanmao

watson77 发表于 2014-3-24 22:38
G2门是不是圈的有点问题？圈的是CD4+群，不是CD4+CD25+群，因此G3实际为Treg/CD4+T，当然比例低了。而且从G ...

设门不是大问题，关键是感觉其foxP3似乎没染上。

ybz

niwanmao 发表于 2014-3-21 20:36
这个kit中的Buffer A和C你是不是都已经按照说明稀释了？

1. Dilute FoxP3 Buffer A (10X concentrate) 1 ...

恩恩！都是现配现做的，而且按比例

niwanmao

ybz 发表于 2014-3-25 10:48
恩恩！都是现配现做的，而且按比例

那么估计是效果不太好，可以换一种破膜剂试试。