关于大鼠TH1/2/17/Treg百分比检测的问题

86964109

是这样的，想检测大鼠外周血样本中TH1/2/17/Treg各种细胞的比率，考虑到流式细胞仪做多色可能有点困难，
1.打算每种细胞分别检测，就是分别做Th1（CD4+/IFN-γ+）、Th2（CD4+/IL-4+）、Th17（CD4+/IL-17A+）以及Treg（CD4+/CD25+/Foxp3）的双染和三染，请较这样也是可以的对吗？

2.请教这种双染，比如对于Th1（CD4+/IFN-γ+）这组来说，我是应该做CD4+、IFN-γ+的同型对照还是做CD4和IFN-γ的单染做补偿（这是不是也相当于FMO了？），还是两种都要做呢？

3.我发现同型对照的选择Th17（CD4+/IL-17A+）这组中是个难题，我没有找到专门针对大鼠IL17A的流式抗体，之前坛子里也有人提到过，eB的抗体Anti-Mouse/Rat IL-17A APC/PE， host为Rat，如果我检测的是小鼠还好，可以用同型抗体Rat IgG2a K Isotype Control APC，但是问题是针对大鼠的样本的话，这个同型抗体还怎么用啊？

4.请教，对于同型对照以及单染的补偿管的加样，同样的指标，如果用于不同的组别样本，是不是也要重新设计各自的同型对照以及单染的补偿管呢，而不是一组就能通用的？



谢谢！

niwanmao

建议每一管加一个CD45，会圈得更好，可排除掉单核细胞混杂。

至于设门对照，建议用FMO。例如Th1、Th2、Th17，均可用CD4、CD45做FMO，而Treg则用CD4、CD25、CD45做FMO。无需同型。

不同组，如果细胞性质不同，建议重做，否则，可通用。

86964109

niwanmao 发表于 2014-7-17 20:23
建议每一管加一个CD45，会圈得更好，可排除掉单核细胞混杂。

至于设门对照，建议用FMO。例如Th1、Th2、Th1 ...

非常感谢。就是说我可以如下4管：
补偿管：CD4 单标，
补偿管：CD45 单标，
补偿管：IFNγ单标
FMO：CD4+CD45
样本管：CD4+CD45+IFNγ
就可以吗？不用分别设各自的同型对照？

但是我还想知道，如果不做CD45的话，我可以把CD4 单标和IFNγ单标看作FMO么？
补偿管：CD4 单标，
补偿管：IFNγ单标
样本管：CD4+IFNγ
是否需要加CD4的同型对照？

另外：检测TH1/2/17需要加刺激剂，还要设未刺激对照组，对于未刺激样本，是否应视为与刺激组样本细胞性质不同，也要和刺激组样本设立同样的实验组别么？

niwanmao

86964109 发表于 2014-7-18 08:46
非常感谢。就是说我可以如下4管：
补偿管：CD4 单标，
补偿管：CD45 单标，

如果不做CD45，补偿管可以这么设，但是除了胞内的IFN、IL17、IL4等，因为这些因子首先要破膜，其次 即使有表达也是很少很弱。所以，建议可以采用两种解决方案：
1、购买商业化的补偿微球，调节补偿。
2、使用经验性的补偿值。

86964109

niwanmao 发表于 2014-7-18 20:00
如果不做CD45，补偿管可以这么设，但是除了胞内的IFN、IL17、IL4等，因为这些因子首先要破膜，其次 即使 ...

谢谢倪老师指教，我再去学习一下

倪shunlan

niwanmao 发表于 2014-7-17 20:23
建议每一管加一个CD45，会圈得更好，可排除掉单核细胞混杂。

至于设门对照，建议用FMO。例如Th1、Th2、Th1 ...

我也准备做这个，很受用啊！

chymanhz

学习了。。。。。。。

olesama001

学习了，我也打算做这个，感觉好难啊，目前还是困惑中

giamay

你好，我最近也要做大鼠的th1/th2/th17/treg的流式，大鼠的这些试剂都在哪个公司定的，我看BD没有大鼠的相关抗体，还有你最后的IL17的问题解决没有，谢谢！

niwanmao

giamay 发表于 2015-4-8 12:01
你好，我最近也要做大鼠的th1/th2/th17/treg的流式，大鼠的这些试剂都在哪个公司定的，我看BD没有大鼠的相 ...

大鼠的抗体确实相对mouse和human来说，难找得多。不过公司还是多的，BD只是其中一小部分，abcam的抗体相对较全，可以找找。
此外，你所说的IL17是什么问题？如果和主题关系不大，建议开新帖提问。