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流式细胞术疑难解答(三):其它

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发表于 2015-1-30 16:49:36 | 显示全部楼层 |阅读模式

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流式细胞术实验结果中,除了信号弱和背景荧光高外,还会碰到其它各种各样的困难。


1、交叉反应
你是否检查过抗体与你的标本之间的兼容性?例如针对小鼠的抗体用在大鼠实验中,效果就可能不一样。所以需要搜索文献,以确定克隆的交叉反应性。你可以在http://www.uniprot.org/上查找抗体之间的交叉反应性,但需要注意的是,即使两个物种之间的抗原存在高度同源性,也不能确保其交叉反应。
下面的PDF文件是biolegend公司的一个交叉反应列表,供参考。

在线免费阅读抗体交叉反应表:
https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NzU2OHxiNDQyY2ZkNnwxNzExNjUwMTc0fDB8

下载(1颗流星):
AntibodyCross-ReactivityChart101512.pdf (513.37 KB, 下载次数: 12, 售价: 1 流星)


2、比较荧光素
你是不是发现PE荧光标记的抗体比FITC的要好一些?因为不同荧光素的亮度不同,所以比较不同荧光素标记的同种抗体检测结果就会造成误导。如果你要比较不同公司出的抗体质量,可以比较同种荧光素标记的抗体。
除了荧光素亮度,还有抗体的最优用量,对结果影响也很大。
还有,不同厂家之间的串联染料性能各不相同(亮度、信噪比),所以在更换串联染料时需要注意。


3、比较克隆号
除了荧光素差别,还需要注意克隆差异。不同的克隆号识别的是抗体不同的表位,而且结合能力也不同。因此,直接比较不同克隆号的性能也是行不通的。

克隆号之间的差异

克隆号之间的差异



4、结果不一致---批间差异
如果你在不同时间做的实验结果发生了变化,你就需要确认一下批号是否一样?如果你最近用了新的批号,那么就需要检查其抗体浓度是否发生了改变。有时候,相同的Test包装,但其推荐抗体用量从20 µL/test减到了5 µL/test。
一般如果换了一支新批号的抗体,最好进行批间比较,以确保抗体性能的稳定性。

5、结果不一致---标本的差异
你是否在检测人类标本?小鼠可以通过基因改造变得一致,但人与人之间的差异很大。所以你在得出实验结论前,需要增加你的样本量,以确保结果准确性。
还有,疾病状态、年龄、人种等都可以影响某个标记的表达水平。
不同批的细胞株也可以使得结果不同。

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