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为什么会存在荧光补偿?如何调节?看图!

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发表于 2015-11-5 20:39:23 | 显示全部楼层 |阅读模式

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流式细胞术的优点是同时可以进行多参数检测,从4色到20多色,快速并且信息量大,然而,不同荧光之间,可能存在的补偿,给很多新手造成了极大的困扰。
荧光之间为什么会存在补偿?以FITC和PE为例,下图中显示的是两者的发射光谱,很明显,两者之间存在很大的重叠,这就意味着FITC发出的光,可能被PE检测器检测到,反之,PE发出的光,也能被FITC检测器检测到:
屏幕快照 2015-11-05 下午8.15.11.png


为了调节补偿,我们需要分别借助FITC单染标本,从PE检测信号中减掉漏过去的FITC荧光,借助PE单染标本,从FITC检测信号中减掉漏过去的PE荧光,最后形成如下图所示的样子,分别使Q1和Q3的FITC MFI相等、使Q4和Q3的 PE MFI相等:
屏幕快照 2015-11-05 下午8.33.47.jpg



但在实际使用过程中,我们要求尽量接近,不一定要使他们的MFI完全一致。
下面是三幅Diva软件中补偿调节的结果图片,a图代表的是正确补偿,b图代表的是过度补偿,c图代表的是补偿未调节到位,大家可以观察一下绿色和红色框内的数字,体会一下正确进行补偿调节的真谛。
屏幕快照 2015-11-05 下午8.34.04.jpg 屏幕快照 2015-11-05 下午8.34.18.jpg 屏幕快照 2015-11-05 下午8.34.31.jpg

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 楼主| 发表于 2019-11-18 19:31:06 | 显示全部楼层
白晶晶2019 发表于 2019-11-18 10:47
倪老师,多色流式是每种荧光素都买CD3的抗体吗?用单参数直方图调节补偿? ...

是的,只是染的细胞需要是T细胞才行。
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发表于 2015-11-5 23:44:25 | 显示全部楼层
“分别使Q1和Q3的MFI相等、使Q4和Q3的MFI相等”---是不是有笔误?
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 楼主| 发表于 2015-11-6 14:39:58 | 显示全部楼层
mengdecao 发表于 2015-11-5 23:44
“分别使Q1和Q3的MFI相等、使Q4和Q3的MFI相等”---是不是有笔误?

少写了两个荧光标记的名称:分别使Q1和Q3的FITC MFI相等、使Q4和Q3的 PE MFI相等
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发表于 2016-4-13 07:23:01 | 显示全部楼层
倪老师,荧光补偿多久调一次比较好?每次测样之前都要调吗?
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 楼主| 发表于 2016-4-13 16:10:57 | 显示全部楼层
aya9988 发表于 2016-4-13 07:23
倪老师,荧光补偿多久调一次比较好?每次测样之前都要调吗?

没有明确要求,关键还是在于仪器性能是否稳定
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发表于 2016-5-26 11:53:42 | 显示全部楼层
老师,可不可以直接修改这个值?还是必须要去荧光补偿那里调?
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 楼主| 发表于 2016-5-26 19:16:39 | 显示全部楼层
冰蓝草 发表于 2016-5-26 11:53
老师,可不可以直接修改这个值?还是必须要去荧光补偿那里调?

改荧光强度值?这改不了的,这个median值本来就是一个统计指标,只有通过荧光补偿调节细胞群体的位置才能使它改变。
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发表于 2016-5-27 09:19:09 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2016-5-26 19:16
改荧光强度值?这改不了的,这个median值本来就是一个统计指标,只有通过荧光补偿调节细胞群体的位置才能 ...

谢谢老师,我试了一下确实改不了,是需要通过荧光补偿来调,真的非常感谢老师,通过看这个median值来调节补偿感觉快多了,以前调的时候总是感觉越调越糊涂,我觉得这个方法对新手特别适用
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发表于 2016-9-13 16:50:12 | 显示全部楼层
本帖最后由 yuan743561169 于 2016-9-13 16:52 编辑

老师,不是Median值吗?怎么图上的圈的都是Mean值呢?还要请教一点,那个MFI值尽量一致但不一定完全一致,有没有一个上下幅度的范围呢
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 楼主| 发表于 2016-9-13 18:26:10 | 显示全部楼层
yuan743561169 发表于 2016-9-13 16:50
老师,不是Median值吗?怎么图上的圈的都是Mean值呢?还要请教一点,那个MFI值尽量一致但不一定完全一致, ...

图是老外那边转的,可能是有些偏差,一般情况下,如果信号呈正态分布,Median和Geomean是一样的。

Median最好完全一致,实在调不好,我觉得统计学上的上下10%是可以的。
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