不能用多聚甲醛预固定的抗体，千万要谨慎

niwanmao

做科研或临床时，可能很多FLOWER习惯性都会用4％多聚甲醛预先固定标本，可能出于三个目的：
（1）为了灭活标本里面可能存在的微生物（细菌、病毒等），起到安全保障作用。
（2）希望标本能够较长时间存放
（3）做胞内染色前的准备。
但是，可能很多人忽视了一点，就是如果在染色之前用多聚甲醛固定标本，细胞表面有些位点在固定后构象发生改变，使得抗体无法结合产生假阴性，也可能由于固定作用，导致其它位点产生非特异性结合（假阳性）。
如下图是CCR8检测，左侧是未固定的标本，可见CCR8是微弱表达，而右侧则是标本预先经过4％多聚甲醛固定，然后再进行表面抗体染色，结果出现明显的假阳性。




因此，知道哪些抗体染色前不能预固定，十分重要。幸好，我们自己不用做验证，在Biolegend公司网站上（http://www.biolegend.com/fixation），贴心的技术人员已经帮我们做了一系列测试，下面两张表，一张是人类抗原，一张是小鼠抗原，可以看的出来，大多数不能做预固定的抗体都是趋化因子受体，所以，大家在实验中千万要注意不要先固定后染色。


表1、4％多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响（人类），打勾的为允许预固定，打叉的表示预固定影响很大



表2、4％多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响（小鼠），打勾的为允许预固定，打叉的表示预固定影响很大

小鼠

zhenghua20

颠覆原来的观点，受益匪浅！

shazhi0507

我们做固定一般是为了过夜存放样品，不过是在表面染色之后在进行固定，平时都没注意到样品预固定可能会产生这样的影响，各位老师好贴心啊~~

shig07

受益匪浅！！

奇天

解决了我心中纠结的问题，超赞

lucky11687

老师 请问那如果是染色完成后 不能马上上机 而再用多聚甲醛固定的话 会影响吗？

niwanmao

lucky11687 发表于 2017-2-24 13:30
老师 请问那如果是染色完成后 不能马上上机 而再用多聚甲醛固定的话 会影响吗？ ...

有些荧光素可能会有影响。

yamapisama2012

FITC和APC染表面后，再固定破膜，染胞内PE，初步试了一下，APC染上了，FITC没有染上，胞内的PE因为没有阳性对照没法说。FITC抗体是没有问题的。固定液是4%多聚甲醛溶液，打孔剂是0.1%的皂素。请问老师有这种FITC在固定破膜后没有染上的情况么，可能存在什么原因呢？

niwanmao

yamapisama2012 发表于 2017-12-14 12:18
FITC和APC染表面后，再固定破膜，染胞内PE，初步试了一下，APC染上了，FITC没有染上，胞内的PE因为没有阳性 ...

FITC的抗体既然不固定能够结合，固定之后从阳全部转阴似乎可能性不大，可能性最大的就是高浓度的多聚甲醛影响了荧光，使自发荧光增强，导致阳性和阴性分群不清。

yamapisama2012

niwanmao 发表于 2017-12-14 12:33
FITC的抗体既然不固定能够结合，固定之后从阳全部转阴似乎可能性不大，可能性最大的就是高浓度的多聚甲醛 ...

那老师的意思是用1%的多聚甲醛？ 那会不会细胞固定不充分？