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设置补偿对照的三大准则

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发表于 2017-7-18 21:40:36 | 显示全部楼层 |阅读模式

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如果没有正确的补偿对照,我们是无法进行荧光补偿调节的,因此在准备实验时,花费时间和精力来设置高质量的补偿对照非常重要。
补偿对照是由于荧光素发射光不是一个单一的波长,而是覆盖一定范围,所以容易使荧光渗漏到邻近波长的检测器。在单个实验中测量的颜色越多,越容易发生荧光渗漏。
补偿是一个数学过程,通过去除每个检测器中邻近通道渗漏的荧光百分比来解决这个问题。

设置高质量的补偿对照有三大准则:
1、每个补偿对照必须与实验样本一样亮或更亮。
见下图,如果你用于设置补偿的阳性群为弱表达的,那么其中位值与阴性群的中位值连接线可能偏离高表达的细胞群体,所以需要用尽可能高表达的补偿对照来调节补偿。
Fig1.jpg

2、对于每个通道中用于补偿计算的阴性群和阳性群,自发荧光水平应该相同。
见下图,如果阴性群和阳性群的自发荧光水平不一致,那么就容易导致补偿错误。
Fig2.jpg

3、使用的荧光素必须是在实验样品中使用的荧光素,应该完全一致,不能用相似波长的其它荧光素替代。
例如你需要调节FITC与PE之间的补偿,那么FITC就不能用GFP替代。
Fig3.jpg


编译源:
https://expertcytometry.com/guid ... ometry-experiments/


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发表于 2017-7-19 18:18:39 | 显示全部楼层
倪老师,对于第一条,我没有理解,还请帮再解释一下,好嘛? 谢谢!
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 楼主| 发表于 2017-7-19 19:06:34 | 显示全部楼层
zj8237277 发表于 2017-7-19 18:18
倪老师,对于第一条,我没有理解,还请帮再解释一下,好嘛? 谢谢!

就是说,每个荧光通道,都要选择最亮的荧光素进行补偿调节,才能使得补偿准确。
例如你要检测CD25 FITC,由于该抗原在淋巴细胞上表达并不很强,所以建议用CD3 FITC调节补偿值,才能准确。
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发表于 2017-7-20 11:33:44 | 显示全部楼层
倪老师,为何要选择最亮的呢?   用本身的不是更为准确嘛?
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 楼主| 发表于 2017-7-20 16:42:49 | 显示全部楼层
zj8237277 发表于 2017-7-20 11:33
倪老师,为何要选择最亮的呢?   用本身的不是更为准确嘛?

原因看上面的图,第1点下面的图画的非常清楚了:)
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发表于 2017-7-21 17:04:36 | 显示全部楼层
好的,谢谢倪老师!
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发表于 2017-10-24 08:44:17 来自手机 | 显示全部楼层
倪老师,第二条不懂呢
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 楼主| 发表于 2017-10-24 14:01:33 | 显示全部楼层
arcangeli 发表于 2017-10-24 08:44
倪老师,第二条不懂呢

自发荧光背景一致,这样才能够排除掉同样的背景,获取准确的补偿值。
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发表于 2019-4-24 23:53:34 来自手机 | 显示全部楼层
倪老师,仪器自动补偿的时候是可以选择以中位值为标准,还是以平均荧光强度为标准的,具体选择中位值还是平均荧光强度呢
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 楼主| 发表于 2019-4-25 14:04:00 | 显示全部楼层
1269189831 发表于 2019-4-24 23:53
倪老师,仪器自动补偿的时候是可以选择以中位值为标准,还是以平均荧光强度为标准的,具体选择中位值还是平 ...

自动补偿不需要你设置的,仪器自动会根据中位数调整的。
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