固定影响了CD4比例？

jmc_1211 · 发表于 2018-11-28 18:08:15

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请教各位老师，
小鼠的外周血做流式分选，
方案一：CD4/8染色后直接流式检测
方案二：CD4/8染色后再作固定通透染foxp3
同样的样本分两个方案检测，上机发现方案二CD4的比例减少一半，这种减少正常吗？是什么原因导致的呢？
CD4标的percp-cy5.5

niwanmao · 发表于 2018-11-30 09:56:05

应该不是CD4减少了，而很可能是因为你固定破膜后，细胞FSC和SSC发生了改变，与很多碎片重叠在一起，导致你圈细胞的时候不纯了。
PS：发帖请选择提问的版块，“流式杂谈”是用于分享实验心得的。

jmc_1211 · 发表于 2018-12-3 09:22:12

首先感谢倪老师，但是
FSC和SSC的变化不是很大，除了CD4以外，其他的表面marker并没有减少，所以觉得很奇怪。CD4是标的percpcy5.5，会不会是因为它受固定剂的影响而导致CD4的比例下降这么多呢？

niwanmao · 发表于 2018-12-3 15:16:19

jmc_1211 发表于 2018-12-3 09:22
首先感谢倪老师，但是
FSC和SSC的变化不是很大，除了CD4以外，其他的表面marker并没有减少，所以觉得很奇怪 ...

尽量把图放出来，这样讨论很辛苦

laoyue · 发表于 2019-8-20 17:07:49

niwanmao 发表于 2018-11-30 09:56
应该不是CD4减少了，而很可能是因为你固定破膜后，细胞FSC和SSC发生了改变，与很多碎片重叠在一起，导致你 ...

倪老师您好，我也遇到了固定破膜后圈门不纯的问题，请问有什么好的解决方法？谢谢您！！

niwanmao · 发表于 2019-8-21 08:37:41

laoyue 发表于 2019-8-20 17:07
倪老师您好，我也遇到了固定破膜后圈门不纯的问题，请问有什么好的解决方法？谢谢您！！ ...

多用系列特异性抗体标记目标细胞

laoyue · 发表于 2019-8-26 23:31:06

niwanmao 发表于 2019-8-21 08:37
多用系列特异性抗体标记目标细胞

您指的是用其他表面marker反选设门吗？
比如我现在跑的是分选过后的CD4 T细胞（固定破膜前CD4的纯度为90%），目的细胞是treg。固定破膜后出现CD4表达降低至40%，则用CD3来圈FSC SSC，从而提高CD4比例？（我是流式小白，麻烦倪老师指点！谢谢！）

niwanmao · 发表于 2019-8-27 22:09:48

laoyue 发表于 2019-8-26 23:31
您指的是用其他表面marker反选设门吗？
比如我现在跑的是分选过后的CD4 T细胞（固定破膜前CD4的纯度为90% ...

你理解的差不多，破膜前后，都用CD3高表达、FSC小、SSC小这三个特征来圈T细胞，然后分析CD4占总CD3＋T的比例

苏沁沁 · 发表于 2019-9-2 16:26:05

我和你的样品一样、也有同样情况、考虑是破膜后损失了一部分细胞、所以少了一些阳性细胞

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