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[结构和原理] 如果做FACS出现系统误差,是不是很可怕?

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发表于 2019-10-18 13:55:26 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
最近在研究干细胞的免疫调控实验,对照组是免疫细胞,实验组是免疫细胞+干细胞。
不管是检测T细胞还是巨噬细胞的指标,不管是细胞内的还是细胞外的,只要是和干细胞共培养的,所检测基因的表达水平都是明显的降低。
理论上应该有升高也有降低的,但是不明白:做了很多次实验了,近十个marker,他们的表达水平都是明显降低的。
我首先怀疑的是自己流式操作有问题,然后是实验设计有问题。
不知道这个系统误差出在哪里?

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 楼主| 发表于 2019-10-18 14:30:05 | 显示全部楼层
是不是用抗体染免疫细胞和干细胞的混合物的时候,干细胞消耗了一部分抗体,造成了免疫细胞的抗原染色强度偏低,所以看到所有免疫细胞标志物在和干细胞共同培养以后都降低?
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 楼主| 发表于 2019-10-18 14:36:13 | 显示全部楼层
这两幅图里面,被圈定在门里面的都是免疫细胞,可以看到从流式染色结果来看,免疫细胞和干细胞一起染色的时候,免疫细胞的染色强度偏低。

免疫细胞

免疫细胞

免疫细胞+干细胞

免疫细胞+干细胞
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发表于 2019-10-19 09:39:19 | 显示全部楼层
cellprobe 发表于 2019-10-18 14:36
这两幅图里面,被圈定在门里面的都是免疫细胞,可以看到从流式染色结果来看,免疫细胞和干细胞一起染色的时 ...

你这两个图里面是什么标记?怎么都挤在右上?
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 楼主| 发表于 2019-10-20 20:19:56 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-10-19 09:39
你这两个图里面是什么标记?怎么都挤在右上?

是PE+APC,可能电压大了,没有调好。
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发表于 2019-10-20 20:52:20 | 显示全部楼层
cellprobe 发表于 2019-10-20 20:19
是PE+APC,可能电压大了,没有调好。

PE和APC是荧光素,我是说你做的是什么抗体?
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 楼主| 发表于 2019-10-20 22:30:28 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-10-20 20:52
PE和APC是荧光素,我是说你做的是什么抗体?

APC是CD14, PE是CD206/TNF-a/IL-6/IL-10。PE是四种标志物,都是降低的趋势。
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 楼主| 发表于 2019-10-20 23:04:05 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-10-20 20:52
PE和APC是荧光素,我是说你做的是什么抗体?

每个样本分成四份,有四个染色方案:APC是CD14, PE的抗体有四种:CD206/TNF-a/IL-6/IL-10,都是降低的趋势。
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发表于 2019-10-22 09:00:12 | 显示全部楼层
cellprobe 发表于 2019-10-20 23:04
每个样本分成四份,有四个染色方案:APC是CD14, PE的抗体有四种:CD206/TNF-a/IL-6/IL-10,都是降低的趋 ...

如果有可能,把完整的设门图放上来,如果上面已经是完整的细胞信号,那么就得考虑电压是不是过高了。
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 楼主| 发表于 2019-10-22 10:05:25 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-10-22 09:00
如果有可能,把完整的设门图放上来,如果上面已经是完整的细胞信号,那么就得考虑电压是不是过高了。 ...

上面两张图是去除细胞碎片得到的数据,应该是电压过高。可是我的问题是所有的免疫细胞在所有的实验中,只要和干细胞共同培养,所有的检测抗原的表达水平都降低,我曾经怀疑是抗体浓度低了的问题,但是我把抗体的浓度加大几倍以后,还是出现这样的趋势。
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