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标题: 细胞周期流式求助！ [打印本页]

作者: 刘文 时间: 2023-10-11 12:12
标题: 细胞周期流式求助！
我试过用6孔板，T25或者大皿收集，收集时的细胞密度为80%左右。（目前我只用control组试验，还未用药刺激）
1.离心去上清，PBS清洗一遍
2.加入250ulPBS将细胞吹成单细胞悬液，缓慢滴加预冷750ul无水乙醇。
3.固定过夜（12-24h）后PBS清洗2遍后，加染液孵育上机。
我试过固定30min,1小时，12小时24小时
24小时时连G2期都没有了
剩余的几个时间段就像图片一样的结果Cv值,分峰不明显。
试过4度固定还有-20度固定区别不大。
刚开始跑出来只有一个单峰，连S期都没有，我考虑是不是细胞生长密度太多产生抑制的原因，后来细胞60%就开始收样，出现了后面的S及G2期，但是一直CV值过高之前有30左右现在改变固定时间（减少之后)CV值20左右，但是仍达不到预期结果

作者: 刘文 时间: 2023-10-11 12:18
各位专家，老师好。周期前前后后做了十次左右，但是一直出现分峰不明显的问题。
1.细胞状态不好?但是是六月份新买的细胞，上机也很少碎片就是不分峰。
2.固定时间和温度:试过固定30min-24 小时，温度4/-20，但是结果好像都差不多。

有同学说是因为我们那个流式机无法采用线性模式，导出来就是对数㏒的?
还有说不用固定做细胞周期…但是不固定怎么染上染料，我没试过。
不知道问题出在哪里？
完完全全按照说明书来的就是没有结果，但是这个实验又是课题重要的一环，不知道咋办…

作者: niwanmao 时间: 2023-10-11 14:17

刘文发表于 2023-10-11 12:18
各位专家，老师好。周期前前后后做了十次左右，但是一直出现分峰不明显的问题。
1.细胞状态不好?但是是六月 ...

使用的试剂、步骤，都分别罗列一下看看，我个人感觉还是出在染色上。

作者: 刘文 时间: 2023-10-11 16:17

niwanmao 发表于 2023-10-11 14:17
使用的试剂、步骤，都分别罗列一下看看，我个人感觉还是出在染色上。

老师，我使用的是碧云天的细胞周期与凋亡试剂盒。
固定完成之后，PBS清洗2遍之后，加入染料常温孵育20-30分钟。
试剂盒PI染液配置:如图片所示我将染液混匀之后加进离心去上清的细胞沉淀中去，然后混匀孵育。

作者: niwanmao 时间: 2023-10-11 20:35

刘文发表于 2023-10-11 16:17
老师，我使用的是碧云天的细胞周期与凋亡试剂盒。
固定完成之后，PBS清洗2遍之后，加入染料常温孵育20-30 ...

很多时候，实验结果都是因为细节而改变。

目前暂时无法明确你的操作细节，但要注意的是：
1、70％的乙醇必须是4℃的。
2、固定时，必须在震荡器上，边震荡70％乙醇，边滴加细胞悬液
3、PI染液中的RNAse不可缺少。

作者: zjl894150094 时间: 2023-10-12 11:57

刘文发表于 2023-10-11 16:17
老师，我使用的是碧云天的细胞周期与凋亡试剂盒。
固定完成之后，PBS清洗2遍之后，加入染料常温孵育20-30 ...

我也是最近用这个试剂盒，按照它的protocol做的，跑了2次正常细胞组，都是一个单峰，看不到G2。用的BD fortessa PE通道，请问你后来解决了吗

作者: niwanmao 时间: 2023-10-12 16:57

zjl894150094 发表于 2023-10-12 11:57
我也是最近用这个试剂盒，按照它的protocol做的，跑了2次正常细胞组，都是一个单峰，看不到G2。用的BD fo ...

是正常什么细胞？如果外周血的细胞，本身就是单峰的。

作者: AAAAAjjj 时间: 2023-10-12 17:50
https://zhuanlan.zhihu.com/p/157 ... ;s_r=0&utm_id=0
这个是比较详细的细胞周期染色的步骤，我之前补实验就是照着这个做的，一次就做出来了，CV值很低。比较重要的一点是你不能直接用实验室和用的消毒酒精去固定，要用无水乙醇稀释为70%的乙醇。还有就是固定时间不用过夜，冰上固定半个小时就可以了。
具体的细节你看看我发的链接。

作者: 刘文 时间: 2023-10-12 20:55

niwanmao 发表于 2023-10-11 20:35
很多时候，实验结果都是因为细节而改变。

目前暂时无法明确你的操作细节，但要注意的是：

好的老师，谢谢，我再重新做，注意细节

作者: 刘文 时间: 2023-10-12 20:56

AAAAAjjj 发表于 2023-10-12 17:50
https://zhuanlan.zhihu.com/p/157591735?utm_source=wechat_session&utm_medium=social&s_r=0&utm_id=0
这 ...

好的，谢谢。我是用的无水乙醇。
250ulPBS+750ul无水乙醇

作者: 刘文 时间: 2023-10-12 20:58

zjl894150094 发表于 2023-10-12 11:57
我也是最近用这个试剂盒，按照它的protocol做的，跑了2次正常细胞组，都是一个单峰，看不到G2。用的BD fo ...

还没有解决，我现在是cv值过高。刚开始是一个单峰（细胞密度过高），现在是做别的实验了，这个做了2月都没做出来，准备先做别的，等我解决了再说😭

作者: macxuao 时间: 2023-10-13 00:14
如果细胞状态没有太大问题，一般这个操作步骤应该没问题的，建议仪器做个QC 看一下微球的CV如何，如果仪器QC的CV都很大，实验步骤如何优化都没用的。

作者: niwanmao 时间: 2023-10-13 08:11

刘文发表于 2023-10-12 20:56
好的，谢谢。我是用的无水乙醇。
250ulPBS+750ul无水乙醇

应是 700ul无水乙醇+300ul纯水，并且没必要一管一管单配，而是可以批量一起配大体积，可以多一点70％冰乙醇固定。

作者: wxd 时间: 2023-10-13 10:06
无水乙醇溶于水放热，所以你向250微升PBS中加预冷的无水乙醇，意义可能不大。还是建议先配好乙醇，预冷后直接加。
说明书上要求固定后进行清洗，以去除残留的乙醇。但其实你可以试试不清洗，仔细弃干净乙醇后，直接加染色液。这个方法经我们验证，是可以得到可接受结果的。
检测时，不要只用PE通道，根据经验，PerCP通道的检测结果可能会比PE通道更好一些。
另外，看你放上来的这个图，你好像没有去除细胞碎片和粘连细胞，可以看看是不是这个的原因。
如果实在做不出来，可以尝试换一个常用的细胞（比如Hela）用同样的方法染色检测一下，看看结果是不是正常的，如果换一个细胞结果就正常了，说明你的这个细胞，细胞周期的结果就是这样的。
有条件的话，尝试用活细胞做细胞周期，比如用DAPI/H33342(405nm激光器激发的蓝色荧光)、SYTO 9/SYBR Green I（488nm激光器激发的绿色荧光）、SYTO 63（633 nm激光器激发的红色荧光）进行染色。具体做法就是在培养细胞的时候，将染料加入培养基中，培养2h以上。需要注意SYBR Green I我们确定可以染色活细菌，但活的动植物细胞没染过，需要确认一下。

作者: 刘文 时间: 2023-10-13 17:57

wxd 发表于 2023-10-13 10:06
无水乙醇溶于水放热，所以你向250微升PBS中加预冷的无水乙醇，意义可能不大。还是建议先配好乙醇，预冷后直 ...

好的，谢谢

作者: 刘文 时间: 2023-10-13 17:58

niwanmao 发表于 2023-10-13 08:11
应是 700ul无水乙醇+300ul纯水，并且没必要一管一管单配，而是可以批量一起配大体积，可以多一点70％冰乙 ...

好的，谢谢

作者: 刘文 时间: 2023-10-13 17:59

macxuao 发表于 2023-10-13 00:14
如果细胞状态没有太大问题，一般这个操作步骤应该没问题的，建议仪器做个QC 看一下微球的CV如何，如果仪器Q ...

好，谢谢

作者: zjl894150094 时间: 2023-10-13 19:40

刘文发表于 2023-10-12 20:58
还没有解决，我现在是cv值过高。刚开始是一个单峰（细胞密度过高），现在是做别的实验了，这个做了2月都 ...

我今天又复测了一下，发现是我的fortessa流式仪电压没调好，电压太高了，细胞飞了。按照老师们的protocol，顺利得到了周期图。

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