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标题: 多聚甲醛固定细胞后怎么保存时间长 [打印本页]

作者: huanghyes 时间: 2011-10-11 18:35
标题: 多聚甲醛固定细胞后怎么保存时间长
多聚甲醛固定好细胞后，需要等其他批次样本一起做，能保存多久，怎么保存？谢谢

作者: niwanmao 时间: 2011-10-11 18:35
你是要测表面标记还是胞内标记？从查阅的文献来看，应该保存4周问题不大。

作者: huanghyes 时间: 2011-10-13 20:37
谢谢，我测组蛋白的磷酸化水平，是胞内标记吧

作者: niwanmao 时间: 2011-10-13 21:45

huanghyes 发表于 2011-10-13 20:37

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谢谢，我测组蛋白的磷酸化水平，是胞内标记吧

组蛋白应该是核内的。

作者: sfqiang23 时间: 2011-11-2 22:35
测表面标记抗原的话能保存多长时间啊？
多聚甲醛怎样加？是在抗体孵育后加多聚甲醛孵育10分钟，离心洗涤后再加pbs放冰箱保存？还是加多聚甲醛后放冰箱保存

作者: niwanmao 时间: 2011-11-2 22:46

sfqiang23 发表于 2011-11-2 22:35

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测表面标记抗原的话能保存多长时间啊？
多聚甲醛怎样加？是在抗体孵育后加多聚甲醛孵育10分钟，离心洗涤后 ...

从站友的测试结果看：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... =1759&fromuid=1，应该看标记而定。
所以我建议你最好先做过比较，如果比较后发现：
1、多聚甲醛固定之后对抗原结合没影响，就可以先加多聚甲醛，放冰箱里保存。具体时间确实没人做过，按照我们平时的经验，我估计4－7天应该可以。
2、如果多聚甲醛对抗原结合有影响，则应该先加抗体孵育，后加多聚甲醛固定，这个时候，由于抗体的荧光会衰减，所以最好不要超过24小时。

作者: sfqiang23 时间: 2011-11-9 23:51
1%的多聚甲醛配制完后在2-4度冰箱中保存多长时间不会有问题啊？有的建议是现用现配。有的说可以保存7天，有的说可以保存3个月，不知究竟多长时间？

作者: niwanmao 时间: 2011-11-10 08:54

sfqiang23 发表于 2011-11-9 23:51

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1%的多聚甲醛配制完后在2-4度冰箱中保存多长时间不会有问题啊？有的建议是现用现配。有的说可以保存7天，有 ...

帮你找了点资料，他们是4％多聚甲醛，保存在玻璃器皿中，4℃不超过7天。看看对你是否有参考意义：http://www.histosearch.com/histo ... raformaldehyde.html

作者: huanghyes 时间: 2011-11-11 10:30
不胜感激

作者: 一成天 时间: 2011-11-11 15:27

niwanmao 发表于 2011-11-2 22:46

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从站友的测试结果看：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=redirect&goto=findpost&ptid=859&pid=1 ...

感谢倪老师啊，我又掌握了个知识点哈哈

作者: chujindong 时间: 2012-2-13 10:35

niwanmao 发表于 2011-11-2 22:46

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从站友的测试结果看：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=redirect&goto=findpost&ptid=859&pid=1 ...

影响荧光抗体衰减的因素都包括什么？如果说温度和光线是主要因素的话，那么在原装的管子里，尚未取出使用时，抗体肯定是不衰减的。即使结合到细胞上之后，只要避光严格，温度合适，抗体就应该也不会衰减。当然这只是推论，我自己没有做过。我最长的放过两天，感觉比较可靠。也有测过之后保存7天以上的，能看到荧光，但是数值没有比较。

作者: niwanmao 时间: 2012-2-13 10:51

chujindong 发表于 2012-2-13 10:35

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影响荧光抗体衰减的因素都包括什么？如果说温度和光线是主要因素的话，那么在原装的管子里，尚未取出使用 ...

你是指标记好抗体，用多聚甲醛固定完毕，放置2天和7天的你都做过？是做什么标记？

作者: chujindong 时间: 2012-2-13 18:53

niwanmao 发表于 2012-2-13 10:51

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你是指标记好抗体，用多聚甲醛固定完毕，放置2天和7天的你都做过？是做什么标记？ ...

有好几种啊，FITC,PE,APC,PERCY-CY5.5.不过我不是说放七天都没有关系，我没有比较，荧光能看到是肯定的。

作者: niwanmao 时间: 2012-2-13 20:26

chujindong 发表于 2012-2-13 18:53

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有好几种啊，FITC,PE,APC,PERCY-CY5.5.不过我不是说放七天都没有关系，我没有比较，荧光能看到是肯定的。 ...

如果有机会，可以测试荧光强度看，把经验分享一下。

作者: zml 时间: 2012-10-29 10:54
各位好，我是刚做流式的新手，想请教下，用多聚甲醛进行样品固定的时候，可不可以直接将样品浸泡在多聚甲醛里到上样前再洗涤后染色上样呢？
我做的样品时细菌，用的多聚甲醛的浓度是1%，实验的目的是想区分不完整的细菌和完整的细菌，染料时PI。请各位多多指教，谢谢了·

作者: niwanmao 时间: 2012-10-29 13:09

zml 发表于 2012-10-29 10:54

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各位好，我是刚做流式的新手，想请教下，用多聚甲醛进行样品固定的时候，可不可以直接将样品浸泡在多聚甲醛 ...

多聚甲醛固定后，很难保证会不会对膜的通透性产生影响，建议还是直接现收现染PI吧。

作者: zml 时间: 2012-10-29 14:14

niwanmao 发表于 2012-10-29 13:09

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多聚甲醛固定后，很难保证会不会对膜的通透性产生影响，建议还是直接现收现染PI吧。 ...

谢谢老师，但是我的样品不能及时处理，那用什么保存方式比较好呢？

作者: niwanmao 时间: 2012-10-29 15:29

zml 发表于 2012-10-29 14:14

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谢谢老师，但是我的样品不能及时处理，那用什么保存方式比较好呢？

我建议：
首先比较一下固定之后与不固定之间是否存在差异，毕竟我没有做过细菌，以上只是从理论上推测。如果没有影响，那么就可以用多聚甲醛固定，如果有，尽可能想办法做新鲜标本。

作者: zml 时间: 2012-10-29 18:06

niwanmao 发表于 2012-10-29 15:29

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我建议：
首先比较一下固定之后与不固定之间是否存在差异，毕竟我没有做过细菌，以上只是从理论上推测。 ...

好的，非常谢谢老师·

作者: liuxin 时间: 2013-3-17 10:42

niwanmao 发表于 2011-11-2 22:46

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从站友的测试结果看：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=redirect&goto=findpost&ptid=859&pid=1 ...

倪老师，要是先家抗体孵育，后用加多聚甲醛固定方案的话，具体是怎么操作呢？
1.多聚甲醛固定多长时间之后用PBS洗一下，加PBS放4度，第二天直接检测；
2.还是直接加好多聚甲醛放4度，第二天PBS洗一下，上机检测？
3.Or 加好多聚甲醛放4度，第二天直接上机。

作者: niwanmao 时间: 2013-3-17 11:05

liuxin 发表于 2013-3-17 10:42

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倪老师，要是先家抗体孵育，后用加多聚甲醛固定方案的话，具体是怎么操作呢？
1.多聚甲醛固定多长时间之 ...

2比较好。

作者: cassiopeia 时间: 2013-12-17 15:01

niwanmao 发表于 2013-3-17 11:05
2比较好。

倪老师，上机前再洗会不会把细胞洗丢了呢？还有洗细胞用1200rpm，5min可以么？

作者: niwanmao 时间: 2013-12-17 18:50

cassiopeia 发表于 2013-12-17 15:01
倪老师，上机前再洗会不会把细胞洗丢了呢？还有洗细胞用1200rpm，5min可以么？ ...

细胞株或细菌，我经验也不足，对于临床标本，细胞丢失或离心速度方面问题都不大。

作者: cassiopeia 时间: 2013-12-18 13:17

niwanmao 发表于 2013-12-17 18:50
细胞株或细菌，我经验也不足，对于临床标本，细胞丢失或离心速度方面问题都不大。 ...

哦，谢谢！

作者: 王娟 时间: 2016-8-25 16:01

niwanmao 发表于 2011-10-11 18:35
你是要测表面标记还是胞内标记？从查阅的文献来看，应该保存4周问题不大。 ...

倪老师，在样品不能及时上机检测的情况下，如果要测细胞表面标记的蛋白，比如CD3、CD4等，又不能用多聚甲醛固定，因为我看群里有说多聚甲醛固定影响CD4与抗体的结合，那最好的方法是什么？

作者: niwanmao 时间: 2016-8-25 18:04

王娟发表于 2016-8-25 16:01
倪老师，在样品不能及时上机检测的情况下，如果要测细胞表面标记的蛋白，比如CD3、CD4等，又不能用多聚甲 ...

试试我们新出来的细胞保存液：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5289-1-1.html

作者: guanyu 时间: 2017-11-30 21:37

niwanmao 发表于 2012-10-29 15:29
我建议：
首先比较一下固定之后与不固定之间是否存在差异，毕竟我没有做过细菌，以上只是从理论上推测。 ...

用标记荧光的抗体与膜蛋白结合后，用4%多聚甲醛固定细胞再用PI染核，固定温度，时间多少合适

作者: guanyu 时间: 2017-12-1 11:10

niwanmao 发表于 2011-11-10 08:54
帮你找了点资料，他们是4％多聚甲醛，保存在玻璃器皿中，4℃不超过7天。看看对你是否有参考意义：http:// ...

这个链接打不开了，老师

作者: niwanmao 时间: 2017-12-1 18:20

guanyu 发表于 2017-12-1 11:10
这个链接打不开了，老师

我这边正常打开。

作者: 花生小将99 时间: 2018-2-26 14:17

niwanmao 发表于 2012-10-29 15:29
我建议：
首先比较一下固定之后与不固定之间是否存在差异，毕竟我没有做过细菌，以上只是从理论上推测。 ...

倪老师，我想请问一下如果我要做流式细胞的质控品试剂盒，细胞要怎么处理呢。

作者: niwanmao 时间: 2018-2-26 14:22

花生小将99 发表于 2018-2-26 14:17
倪老师，我想请问一下如果我要做流式细胞的质控品试剂盒，细胞要怎么处理呢。 ...

如果希望长期保存，大多数是采用液氮冻存的方式。

作者: 花生小将99 时间: 2018-2-26 14:55

niwanmao 发表于 2018-2-26 14:22
如果希望长期保存，大多数是采用液氮冻存的方式。

可是如果我是要开发一种商品化的流式细胞检测试剂盒，里面的质控品肯定无法抑制液氮冻存的，

作者: niwanmao 时间: 2018-2-26 16:00

花生小将99 发表于 2018-2-26 14:55
可是如果我是要开发一种商品化的流式细胞检测试剂盒，里面的质控品肯定无法抑制液氮冻存的， ...

两种方法：
1、采用特殊方法进行冻干（Biolegend等厂家有此工艺）。
2、采用特殊保存液。

作者: 浙大小童鞋 时间: 2018-3-25 13:44

niwanmao 发表于 2016-8-25 18:04
试试我们新出来的细胞保存液：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5289-1-1.html

倪老师，我是做细胞表面抗体标记，由于晚上做，需要过夜，那么固定是用1%多聚甲醛固定多少分钟，再用PBS洗两遍，4度过夜；还是直接多聚甲醛重悬后4度过夜，第二天直接上机。

作者: niwanmao 时间: 2018-3-25 15:06

浙大小童鞋发表于 2018-3-25 13:44
倪老师，我是做细胞表面抗体标记，由于晚上做，需要过夜，那么固定是用1%多聚甲醛固定多少分钟，再用PBS ...

1%的话，可以固定10分钟后用PBS重悬，也可以固定过夜。

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