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标题: 流式抗体滴定：关键要点与步骤 [打印本页]

作者: niwanmao 时间: 2024-10-13 13:28
标题: 流式抗体滴定：关键要点与步骤
流式细胞术（Flow Cytometry）能为免疫学研究提供更细致的实验证据。而在这个过程中，抗体滴定（Antibody Titration）是实验成功的关键步骤。今天，我们就来聊聊抗体滴定的那些事儿。

什么是抗体滴定？

抗体滴定是确定最佳抗体浓度的过程，这一浓度能够最好地区分阳性信号和背景噪声。这个过程涉及到对一系列抗体稀释度的评估，以找到在饱和所有结合位点的同时，找到最小化的抗体浓度。

为什么抗体滴定如此重要？
1. 提高数据分辨率：正确的抗体浓度可以提高信号与噪声的比例，从而提高数据的分辨率。
2. 避免非特异性结合：抗体过量可能导致非特异性结合，影响结果的准确性。
3. 资源优化：合理的抗体浓度可以避免资源的浪费，减少实验成本。

抗体滴定的步骤

单个抗体滴定后，多色流式方案如何继续？
多色流式细胞术中，抗体滴定变得更加复杂，因为需要考虑多个抗体之间的相互作用和最佳的组合。以下是进行多色方案中抗体滴定的步骤和策略：
1. 单克隆抗体滴定：在进行多色实验之前，首先对每个单克隆抗体进行单独的滴定，以确定每个抗体的最佳工作浓度。这一步骤是基础，确保每个抗体在后续的多色实验中都能发挥最佳效果。
2. 考虑荧光素的兼容性：在多色实验设计中，需要考虑不同荧光素之间的光谱重叠。选择那些光谱特性互补的荧光素，以减少光谱溢出和提高分辨率。
3. 逐步构建多色方案：逐步添加抗体到你的实验方案中。通常从最亮的标记开始，然后逐步添加较暗的标记。这样可以帮助你更容易地调整滴定浓度，以适应多色设置。
4. 空间竞争的考虑在多色实验中，抗体可能会在细胞表面竞争位置相近的结合位点。因此，可能需要调整单个抗体的浓度，以确保所有抗体都能有效地结合到它们的目标上。
5. 顺序染色在某些情况下，可能需要采用顺序染色的方法，即先添加一部分抗体，洗涤后再添加另一部分抗体。这种方法可以帮助减少抗体之间的直接竞争，并可能提高整体的染色效果。
6. 多色样品的优化在所有抗体都被添加到方案中后，进行多色样品的滴定，以评估和优化整体的染色效果。这可能需要对单个抗体的浓度进行微调。
7. 持续评估和调整：即使在最初的多色方案建立之后，也需要持续评估和调整。每次实验条件变化（如抗体批次更换、细胞类型变化等）时，都可能需要重新进行滴定。
8. 文档记录：记录每个抗体的滴定结果和最终使用的浓度，这对于实验的可重复性和后续的数据分析至关重要。

多色流式细胞术的抗体滴定是一个迭代和细致的过程，需要耐心和精确的实验设计。通过上述步骤，就可以优化你的多色方案，以获得最好的实验结果。

信源：Bonilla DL, Paul A, Gil-Pulido J, Park LM, Jaimes MC. The Power of Reagent Titration in Flow Cytometry. Cells. 2024; 13(20):1677. https://doi.org/10.3390/cells13201677

作者: shf872747901 时间: 2024-11-29 09:49
”对于以mg/mL提供的抗体，从1000ng/Test开始稀释，在最终体积为200 µL中，或根据多色染色使用的体积进行调整”倪老师，这里和下面的图对不上，是不是应该是ug/mL

作者: niwanmao 时间: 2024-11-29 10:24

shf872747901 发表于 2024-11-29 09:49
”对于以mg/mL提供的抗体，从1000ng/Test开始稀释，在最终体积为200 µL中，或根据多色染色使用的体积进行 ...

已纠正，希腊字母在转码的时候被识别成m了

作者: zzzlll. 时间: 2024-12-5 09:00
请问如果检测的时候发现没有明显的分群该如何滴定？

作者: niwanmao 时间: 2024-12-5 09:39

zzzlll. 发表于 2024-12-5 09:00
请问如果检测的时候发现没有明显的分群该如何滴定？

如果在A细胞没有发现明显分群，说明A细胞不适合用于滴定，建议选择分群明显的B细胞来替代，因为滴定主要是确认抗体最佳染色浓度，与细胞类型无关

作者: zzzlll. 时间: 2024-12-5 10:41

niwanmao 发表于 2024-12-5 09:39
如果在A细胞没有发现明显分群，说明A细胞不适合用于滴定，建议选择分群明显的B细胞来替代，因为滴定主要 ...

好的，谢谢！

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