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标题: 求MOUSE外周血溶血方法 [打印本页]

作者: luqhcolalove 时间: 2012-5-11 14:34
标题: 求MOUSE外周血溶血方法
本人最近在做MOUSE的外周血标志，但溶血效果不好，有没有做过的，提供下溶血方案。

作者: niwanmao 时间: 2012-5-11 14:56
你用的是站内这个配方的氯化铵裂解液吗？http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=178

如果确实不行，试试这个配方看：
RBC lysis buffer (388 mM NH4Cl, 29.7 mM NaHCO3, 25 µM Na2EDTA)

20.75 g. NH4Cl
2.5 g. NaHCO3
0.093 g. Na2EDTA
1 L. H2O

转自：fred hutchinson cancer research center http://labs.fhcrc.org/fero/Protocols/MouseCBC.html

作者: samly0 时间: 2012-5-12 12:44
我们实验室自己配的是Tris-NH4Cl裂解液来溶血的，你也可以试试，不知道跟氯化铵裂解液相比在使用上有什么区别和限制，我个人用Tris-NH4Cl裂解液溶过小鼠的外周血和脾脏组织制备的细胞悬液，人外周血和骨髓血，效果都不错的，下面是配方：
二羟甲基氨基甲烷（BIS-TRISBR） 1.03 g
NH4Cl 3.735g
H2O 500 ml
加适量HCl溶液调节PH值至7.2
10的8次方细胞量的情况下大概加5mlTris-NH4Cl裂解液溶3至5分钟就可以了，不过细胞不同实验室条件不同，这个细胞量对应多少液体溶多长时间可能还需要根据自己的情况稍做调整的

作者: luqhcolalove 时间: 2012-5-14 10:09
先谢二位帮忙，本人用的是BD进口Lyse溶血素，不过效果不好，有很多碎片，Mouse外周血白细胞物理参数图跟人的外周血分布差不多吗？还是要小？

作者: niwanmao 时间: 2012-5-14 10:14

luqhcolalove 发表于 2012-5-14 10:09

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先谢二位帮忙，本人用的是BD进口Lyse溶血素，不过效果不好，有很多碎片，Mouse外周血白细胞物理参数图跟人 ...

BD的裂解液我用在人外周血和骨髓上面效果也不好。
还是勤劳一点，自己配吧，呵呵。

小鼠的外周血，我印象中似乎帮研究生测过，分布差不多，电压应该要稍微比人的要调大一点。

作者: renping_jsnj 时间: 2012-5-16 17:12
感觉BD的裂解液其protocol主要是针对human的样本，当运用到mouse/rat时就需要做适当的调整。我们用BD的fix/lyse buffer同时做human和mouse的全血，发现human用的没有问题，mouse的粒细胞就会丢失的非常明显。所以mouse是需要调整孵育时间的，要短一些才好。最好是自己先摸索一下。

作者: norman204 时间: 2012-7-2 07:21
记得深圳达科为有专门的小鼠红细胞裂解液。

作者: niwanmao 时间: 2012-7-2 08:19

norman204 发表于 2012-7-2 07:21

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记得深圳达科为有专门的小鼠红细胞裂解液。

成份是否了解？是否跟上面samly0提供的配方差不多？

作者: laikete 时间: 2012-10-25 14:01
外周血我们实验室用的最简单的水裂解，效果一直都还可以

作者: niwanmao 时间: 2012-10-25 19:58

laikete 发表于 2012-10-25 14:01

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外周血我们实验室用的最简单的水裂解，效果一直都还可以

不会吧？从原理上说水属于低渗裂解，但似乎没看到过哪篇文章用过这方法吧

作者: laikete 时间: 2012-10-26 11:00

niwanmao 发表于 2012-10-25 19:58

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不会吧？从原理上说水属于低渗裂解，但似乎没看到过哪篇文章用过这方法吧 ...

我们都是用这种方法，裂解效果非常好，淋巴细胞，单核细胞，粒细胞分的特别清楚，主要是我们免疫学小鼠方面的文章放外周血的图很少

作者: niwanmao 时间: 2012-10-26 12:09

laikete 发表于 2012-10-26 11:00

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我们都是用这种方法，裂解效果非常好，淋巴细胞，单核细胞，粒细胞分的特别清楚，主要是我们免疫学小鼠方 ...

是直接用蒸馏水处理10－15分钟吗？多少量？

作者: laikete 时间: 2012-10-26 14:34

niwanmao 发表于 2012-10-26 12:09

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是直接用蒸馏水处理10－15分钟吗？多少量？

我们一般是这样：
外周血肝素抗凝100-200ul置冰上，另预先准备好9ml预冷的蒸馏水（15ml管中）
将血加入到9ml水中吹打约20-30sec（根据血量多少）
30sec后加入1ml 10*PBS终止反应
1700rpm 离心5min，倒掉上清，拿缓冲液（如PBSA）重悬沉淀即可分管染色上机

作者: niwanmao 时间: 2012-10-26 21:02

laikete 发表于 2012-10-26 14:34

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我们一般是这样：
外周血肝素抗凝100-200ul置冰上，另预先准备好9ml预冷的蒸馏水（15ml管中）
将血加入到 ...

这种做法让我想起染色体标本处理之前的计数，一般用2—4%的冰醋酸裂解红细胞，获得较纯的白细胞进行计数。
也有用冰醋酸和甲醇1:3混合。

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