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标题: 求助Foxp3 [打印本页]

作者: 严青V 时间: 2013-6-8 09:44
标题: 求助Foxp3
因为Foxp3貌似分群也不是很理想，所以就有人建议我将PE-CY5FOXP3换成APC的了，但是分群也不是很好。我该怎么办？我看了一下Foxp3的使用说明书，它上面的图分的群也不是很清，但是它做了同型对照。是不是Foxp3就是分群不好，所以才需要做同型对照。我如果做了同型对照是不是就可以解决问题了？我将我的流式数据和Foxp3的说明书添加到附件，还请老师帮忙解答，感激不尽

作者: 严青V 时间: 2013-6-8 11:33
@niwanmao 倪老师帮我看一下吧

作者: niwanmao 时间: 2013-6-8 12:59

严青V 发表于 2013-6-8 11:33

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@niwanmao 倪老师帮我看一下吧

foxP3做到与阴性细胞群分得非常开，很难。我也因此而改用了CD127。不过我看了下您的两个数据，感觉APC的FOXP3稍微分群好一些，PE的稍差。数据应该是可以用的。

分析结果如下图片（3张），你要看的就是R-1 AND R-2 AND R-4，这里统计结果显示的比例是占所有的细胞比例，如果你要计算占淋巴细胞比例，只需将R-1 AND R-2 AND R-4的Events除以R-1的Events即可：
[attach]3441[/attach][attach]3439[/attach][attach]3440[/attach]

作者: 严青V 时间: 2013-6-8 14:43

niwanmao 发表于 2013-6-8 12:59

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foxP3做到与阴性细胞群分得非常开，很难。我也因此而改用了CD127。不过我看了下您的两个数据，感觉APC的F ...

这是太谢谢倪老师了，因为实验的标书上是这样设计的，我不知道能不能改用CD127，如果我不换用APC通道的，是不是也可以，还有就是我需不需要做同型对照？

作者: niwanmao 时间: 2013-6-8 14:56

严青V 发表于 2013-6-8 14:43

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这是太谢谢倪老师了，因为实验的标书上是这样设计的，我不知道能不能改用CD127，如果我不换用APC通道的， ...

APC有的话最好用APC，至少这两个数据文件中，我更倾向于APC。

对照的话，严格来说，应该是FMO对照最好。即做一管CD4、CD25，其它什么都不加的。

作者: 严青V 时间: 2013-6-8 15:13

niwanmao 发表于 2013-6-8 14:56

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APC有的话最好用APC，至少这两个数据文件中，我更倾向于APC。

对照的话，严格来说，应该是FMO对照最好。 ...

因为之前我的师姐已经做了一部分，我所需的标本比较难收，重新做，所要花费时间太长。我如果这个图可以用于发文章的话，我就不想换了，不知道行不行。附件中是我上一次做的还有只标CD4和CD25的，但是我不知道阳性群的十字架，应该放在什么地方

作者: 严青V 时间: 2013-6-8 15:18
@niwanmao

作者: niwanmao 时间: 2013-6-8 15:38

严青V 发表于 2013-6-8 15:18

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@niwanmao

我看keti2.rar这个压缩文件中的两个数据，似乎细胞状态不一致，是不是用的不是同一批细胞？这样做FMO对照不行。不过光看FOXP3那管分群挺好的，你分析的时候别用十字门，就象我上面那样，自己圈。

附分析结果
[attach]3445[/attach]

作者: 严青V 时间: 2013-6-8 15:56
@niwanmao是同一批做的啊，做FMO对照不是要确定一个标准来和所要做的做对比吗？就是把对照管中没有凸起来的部分圈起来就行了吗？是不是不需要以坐标为标准？还有就是每一次都要做一次对照吗？

作者: niwanmao 时间: 2013-6-8 16:34

严青V 发表于 2013-6-8 15:56

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@niwanmao是同一批做的啊，做FMO对照不是要确定一个标准来和所要做的做对比吗？就是把对照管中没有凸起来 ...

处理同一批我懂，我的意思是你的细胞肯定不是同一瓶的，状态相差太大了。
圈就象我图中那样圈，就是略有分离的这块。坐标不需要太在意。
如果可能，尽可能每次都做一个，那是最好的。实在经济受限，也可以不做。

作者: 严青V 时间: 2013-6-8 16:38

niwanmao 发表于 2013-6-8 16:34

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处理同一批我懂，我的意思是你的细胞肯定不是同一瓶的，状态相差太大了。
圈就象我图中那样圈，就是略有 ...

在此谢谢倪老师了，真是帮了我一个大忙，谢谢！

作者: niwanmao 时间: 2013-6-8 16:43

严青V 发表于 2013-6-8 16:38

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在此谢谢倪老师了，真是帮了我一个大忙，谢谢！

不客气，常来交流交流。同时以你的那些特长和经验帮助后来的新手。

作者: 严青V 时间: 2013-6-8 16:59

niwanmao 发表于 2013-6-8 16:43

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不客气，常来交流交流。同时以你的那些特长和经验帮助后来的新手。 ...

嗯，一定

作者: 严青V 时间: 2013-6-8 17:05

niwanmao 发表于 2013-6-8 16:43

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不客气，常来交流交流。同时以你的那些特长和经验帮助后来的新手。 ...

嗯，一定

作者: dragonhzqsmmu 时间: 2013-6-13 15:55

niwanmao 发表于 2013-6-8 12:59

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foxP3做到与阴性细胞群分得非常开，很难。我也因此而改用了CD127。不过我看了下您的两个数据，感觉APC的F ...

请教一下老师，您第二张的图片显示CD4 AND PE-CY7-A，这个因为他没有这个通道，是随便选择一个空白通道以便圈出CD4 POS的群，还是有特殊的选择理由，用FSC或者SSC与CD4联合可以吗？
另外PE-Cy7-A AND CD4的图片里面看是否除了CD4阴性的群还有一群CD4 dim的群？

作者: dragonhzqsmmu 时间: 2013-6-13 15:56
另外想学习一下您的R4的群是如何确定的？CD25在人的Treg是否有negative到Dim到Bright的过渡？

作者: dragonhzqsmmu 时间: 2013-6-13 16:16
倪老师，我下载了原始数据学习着分析了一下，我是从第一行的density plot开始的，因为从左边的dotplot看不出来lymphocytes群落的边缘界限，逆时针分析的，用的是FSC AND CD4界定的CD4阳性的群落，最后的结果和您的有点出入。

作者: niwanmao 时间: 2013-6-14 08:30

dragonhzqsmmu 发表于 2013-6-13 15:55

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请教一下老师，您第二张的图片显示CD4 AND PE-CY7-A，这个因为他没有这个通道，是随便选择一个空白通道以 ...

1、PE-CY7是随便选的，你也可以用SSC或FSC，看个人喜好，CD4那个散点图就是为了圈出CD4阳性的细胞。

2、CD4和PE-CY7散点图里面那群CD4 dim的，很有可能是一些单核细胞污染，故不圈。

作者: niwanmao 时间: 2013-6-14 08:33

dragonhzqsmmu 发表于 2013-6-13 15:56

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另外想学习一下您的R4的群是如何确定的？CD25在人的Treg是否有negative到Dim到Bright的过渡？ ...

CD25的分布确实从阴性到阳性连续性分布。R4群的确定可以通过将图拉大，就容易看出其分群，圈中这个分群的边界即可。

作者: niwanmao 时间: 2013-6-14 08:42

dragonhzqsmmu 发表于 2013-6-13 16:16

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倪老师，我下载了原始数据学习着分析了一下，我是从第一行的density plot开始的，因为从左边的dotplot看不 ...

我的658，你的561，基本接近，我觉得好像关键在R4的位置上稍微有一点偏移，可以再靠左下一点。

附参考设门：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... tid=2104&ctid=6

作者: dragonhzqsmmu 时间: 2013-6-15 07:31
因为没有FMO的对照，是否R4的群只能考经验来圈了，如果有FMO对照，圈群就把握更大了？

作者: niwanmao 时间: 2013-6-15 11:05

dragonhzqsmmu 发表于 2013-6-15 07:31

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因为没有FMO的对照，是否R4的群只能考经验来圈了，如果有FMO对照，圈群就把握更大了？ ...

确实。对于这种分群不清的情况，FMO对照显得尤为重要。

作者: liaoyanchun 时间: 2013-7-4 17:18

niwanmao 发表于 2013-6-8 16:34

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处理同一批我懂，我的意思是你的细胞肯定不是同一瓶的，状态相差太大了。
圈就象我图中那样圈，就是略有 ...

老师你好,染foxp3是不是必须用破核膜的破膜剂,用fix&perm那一套可以吗

作者: niwanmao 时间: 2013-7-4 17:51

liaoyanchun 发表于 2013-07-04 17:18:55

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老师你好,染foxp3是不是必须用破核膜的破膜剂,用fix&perm那一套可以吗

必须要有特定的破核膜成份。invitrogen fix&perm不能用于foxP3

作者: wwwww 时间: 2015-1-6 21:12

niwanmao 发表于 2013-6-8 12:59
foxP3做到与阴性细胞群分得非常开，很难。我也因此而改用了CD127。不过我看了下您的两个数据，感觉APC的F ...

我也在检测foxp3 也是分群不明显而且阳性率很小流式图就是显示阴性细胞飘过来一点就是阳性率不知这样算不算阳性细胞呢谢谢请赐教

作者: niwanmao 时间: 2015-1-7 06:42

wwwww 发表于 2015-1-6 21:12
我也在检测foxp3 也是分群不明显而且阳性率很小流式图就是显示阴性细胞飘过来一点就是阳性率不知这样 ...

注意看论坛就不会提这种问题了，呵呵，昨天刚好有一位站友提过treg，他的结果非常好，可以参考一下：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4106-1-1.html

作者: wwwww 时间: 2015-1-7 21:14

niwanmao 发表于 2015-1-7 06:42
注意看论坛就不会提这种问题了，呵呵，昨天刚好有一位站友提过treg，他的结果非常好，可以参考一下：http ...

谢谢老师

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