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标题: JC-1检测线粒体膜电位 [打印本页]

作者: 周利 时间: 2014-6-12 11:48
标题: JC-1检测线粒体膜电位
大虾们：
      小虾米求救，我最近要检测线粒体膜电位，用的是cayman的盒子，染色说明如下：
      我做的是人骨肉瘤细胞，是个贴壁细胞，它说前一天接种细胞，第二天染色，37℃孵育15-30min，收获细胞上机检测，我不知道如何收获细胞，需要消化吗？还是刮下来？如果消化会对前面的染色有影响吗？
      希望大家帮帮我！

作者: didi_zhou 时间: 2014-6-12 11:48

周利发表于 2014-6-20 11:13
补偿没有调，我用的机器是贝克曼的FC500，它在调的时候，电压和补偿只能选一个，不能同时调，我上了 ...

也没有谁会同时调的。打开SetupMode，你可以用QuickSet调完电压以后直接点QuickComp调补偿，一管就可以做完，也不用上两次。调补偿的时候用处理组的就好了。
另外用FC500的话使用1、3通道来做JC-1会更好，第三通道是610，补偿更好调。

作者: niwanmao 时间: 2014-6-12 20:00
对于自配试剂的，JC-1一般用DMSO配成1000x储存液(5 mg/ml)。
如果是标记贴壁细胞，需先将JC-1储存液用培养基稀释至5 µg/ml的工作液（稀释时注意边稀释边振荡，以防止沉淀形成），然后再将加了JC-1的培养基加到贴壁细胞中，37℃孵育10分钟或室温15分钟，最后用PBS洗涤两次、胰蛋白酶消化，500 µl PBS重悬，上机分析。

同时给做悬浮细胞的站友提个方案，如果是悬浮细胞，可将悬浮细胞与用培养基稀释至10 µg/ml 的JC-1溶液以1：1混合，最终浓度5 µg/ml，同样37℃孵育10分钟或室温15分钟，最后用PBS洗涤两次，500 µl PBS重悬，上机分析

相关链接：http://www.meduniwien.ac.at/user/johannes.schmid/JC1staining.htm

作者: 周利 时间: 2014-6-13 09:03
老师，我还想问问，1.我的盒子JC-1是液体的，说明书上有说JC-1的稀释方法，用相应的细胞培养液1：10稀释，盒子里也有Assay Buffer ，我想清洗细胞的时候是不是用这个就可以了？
2. 我是第一次做这个实验，我的盒子里没有做阳性处理的药物，我能不能用5氟尿嘧啶诱导一下，作为阳性对照？

作者: niwanmao 时间: 2014-6-13 13:09

周利发表于 2014-6-13 09:03
老师，我还想问问，1.我的盒子JC-1是液体的，说明书上有说JC-1的稀释方法，用相应的细胞培养液1：10稀释， ...

1、如果成分跟pbs差不多，也可以用。
2、可以试试。:)

作者: 周利 时间: 2014-6-18 14:04
老师，我今天做了一下线粒体膜电位检测，做了2管，一管是正常的细胞，一管是加了NaF 诱导的细胞，同时用JC-1染色，结果如下，两管没有什么变化，您看我的结果合适吗？

作者: niwanmao 时间: 2014-6-18 20:32

周利发表于 2014-6-18 14:04
老师，我今天做了一下线粒体膜电位检测，做了2管，一管是正常的细胞，一管是加了NaF 诱导的细胞，同时用JC- ...

NaF能够肯定诱导线粒体膜电位降低吗？似乎CCCP用的多吧。

从这两张图看，两者没有区分。

作者: didi_zhou 时间: 2014-6-19 18:26
补偿没调吧。

作者: 周利 时间: 2014-6-20 11:13
补偿没有调，我用的机器是贝克曼的FC500，它在调的时候，电压和补偿只能选一个，不能同时调，我上了两管，一管未处理细胞，一管加了NaF的细胞，我用第一管把细胞调到了对角线上，直接上了第二关，问题有两个，一是图不好看，不是椭圆型的一坨，二是两管没有差别，CCCP我已经订购了，希望拿它处理后会有阳性结果。

作者: 周利 时间: 2014-6-21 14:36
今天又做了一下线粒体膜电位检测，有了好的结果，之前的图是没有调补偿惹的祸，谢谢大家的帮助！

作者: niwanmao 时间: 2014-6-21 19:37

周利发表于 2014-06-21 14:36:48

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今天又做了一下线粒体膜电位检测，有了好的结果，之前的图是没有调补偿惹的祸，谢谢大家的帮助！

上面两个图感觉即使调了补偿差别也不大吧

作者: 周利 时间: 2014-6-23 14:32
老师，您说的太对了，我礼拜六又做了一次，调补偿后出来了很好的结果，我用的是1、2通道，确实补偿调的很多，至于可以3通道我还没试，下次做可以试试!

作者: 周利 时间: 2014-6-24 09:51

didi_zhou 发表于 2014-6-12 11:48
也没有谁会同时调的。打开SetupMode，你可以用QuickSet调完电压以后直接点QuickComp调补偿，一管就可以做 ...

老师，我还想问问，为什么在直方图上看，处理后的细胞FL2通道的红色荧光从92.4%降低到了24.5%，而FL1通道的绿色荧光变化不大呢？从99%变化到98.2%

作者: didi_zhou 时间: 2014-6-24 21:16
从原理上相就知道，游离的染料（绿色）肯定是大量且“过量”的，且遍布在细胞内，即使细胞没有凋亡，一个细胞里面也会存在游离的JC-1（绿色、大量）和聚合体（橙色，在线粒体膜上、少量），所以细胞群会在右上角。你能看见的凋亡变化主要是橙色这部分强度变小（明显），绿色基本不变。这个跟这个实验的原理有关。

作者: didi_zhou 时间: 2014-6-24 21:16

周利发表于 2014-6-24 09:51
老师，我还想问问，为什么在直方图上看，处理后的细胞FL2通道的红色荧光从92.4%降低到了24.5%，而FL1通道 ...

从原理上相就知道，游离的染料（绿色）肯定是大量且“过量”的，且遍布在细胞内，即使细胞没有凋亡，一个细胞里面也会存在游离的JC-1（绿色、大量）和聚合体（橙色，在线粒体膜上、少量），所以细胞群会在右上角。你能看见的凋亡变化主要是橙色这部分强度变小（明显），绿色基本不变。这个跟这个实验的原理有关。

作者: 周利 时间: 2014-6-26 14:44

didi_zhou 发表于 2014-6-24 21:16
从原理上相就知道，游离的染料（绿色）肯定是大量且“过量”的，且遍布在细胞内，即使细胞没有凋亡，一个 ...

老师，非常感谢，您的回答点醒了我！

作者: shanshui 时间: 2014-7-4 15:20

周利发表于 2014-6-26 14:44
老师，非常感谢，您的回答点醒了我！

你好，你能贴一下成功后的实验结果，让大家和之前的对比看一下吗？

作者: 周利 时间: 2014-7-18 09:27

shanshui 发表于 2014-7-4 15:20
你好，你能贴一下成功后的实验结果，让大家和之前的对比看一下吗？

我贴一下我做的贴壁细胞的图片

作者: 周利 时间: 2014-7-18 09:43

niwanmao 发表于 2014-6-21 19:37
上面两个图感觉即使调了补偿差别也不大吧

老师，我昨天做了一次悬浮细胞的线粒体膜电位检测，不明白正常细胞左上象限为什么会有一坨细胞，您帮我分析一下

作者: niwanmao 时间: 2014-7-18 12:02

周利发表于 2014-07-18 09:43:51

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老师，我昨天做了一次悬浮细胞的线粒体膜电位检测，不明白正常细胞左上象限为什么会有一坨细胞，您帮我分

你圈中这群细胞，反过来看看它位于FSC/SSC的哪个位置

作者: 周利 时间: 2014-7-18 14:42

niwanmao 发表于 2014-7-18 12:02
你圈中这群细胞，反过来看看它位于FSC/SSC的哪个位置

我反圈门了，他在主群里，而且在密度最高的地方。到是可以通过补偿把它们调到F2象限，但我不知道是不是合适？因为即使调过去了，好像还是两群

作者: niwanmao 时间: 2014-7-18 22:14

周利发表于 2014-7-18 14:42
我反圈门了，他在主群里，而且在密度最高的地方。到是可以通过补偿把它们调到F2象限，但我不知道是不是合 ...

以后再重复几次看看，是不是偶发性的假信号。

作者: 小小研究生 时间: 2015-1-29 20:21

周利发表于 2014-6-21 14:36
今天又做了一下线粒体膜电位检测，有了好的结果，之前的图是没有调补偿惹的祸，谢谢大家的帮助！ ...

请问，贝克曼的补偿怎么调，在什么情况下需要调，我做JC-1三次了都是失败，希望给点意见

作者: niwanmao 时间: 2015-1-30 10:42

小小研究生发表于 2015-1-29 20:21
请问，贝克曼的补偿怎么调，在什么情况下需要调，我做JC-1三次了都是失败，希望给点意见 ...

贝克曼什么机型，如果是FC500，站内有教程：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4161-1-1.html

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