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标题: 我新手做的TREG流式，图怎么看啊 [打印本页]

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-10 21:47
标题: 我新手做的TREG流式，图怎么看啊
我做的全血的TREG检测，只是加的CD4APC,CD25PE双染，取50UL的血各加5ul的抗体，这个结果图请问怎么分析啊，最后的那个十字门应该怎么定位才能确定双阳性比例？第一次做关于细胞的实验，搞了好几天看网上的说明怎么搞都不行啊{:soso_e109:}

作者: RIVA 时间: 2014-8-11 10:15
建议把原始数据发上来~

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-11 10:28

RIVA 发表于 2014-8-11 10:15
建议把原始数据发上来~

原始数据

作者: RIVA 时间: 2014-8-11 10:44
哪一个是同型对照？

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-11 10:46

RIVA 发表于 2014-8-11 10:44
哪一个是同型对照？

只是做了个CD25同性对照，按时间顺序第一个PE

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-11 10:48

woshishuilz 发表于 2014-8-11 10:46
只是做了个CD25同性对照，按时间顺序第一个PE

我后面又做了好几次，可是每次做流式老师都没有把我的调电压和调补偿的数据保存下来，每次都是把后面的双染的数据保存下来怎么办，那个后面的十字门怎么设？

作者: RIVA 时间: 2014-8-11 12:22

woshishuilz 发表于 2014-8-11 10:48
我后面又做了好几次，可是每次做流式老师都没有把我的调电压和调补偿的数据保存下来，每次都是把后面的双 ...

没办法，如果从你获取的图形看CD25没有染上，要不确实就没有~

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-11 12:28

RIVA 发表于 2014-8-11 12:22
没办法，如果从你获取的图形看CD25没有染上，要不确实就没有~

那CD4染上了不？

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-11 12:49

RIVA 发表于 2014-8-11 12:22
没办法，如果从你获取的图形看CD25没有染上，要不确实就没有~

我看网上说CD25是诱导性表达分子，且表达量不均一，或多或少，荧光信号有强有弱，一般在流式分析分析图上呈连续散点，那我可不可以在单独做下CD25的单标，看看其荧光表达到底怎么样？因为我做了好几十管都差不多

作者: RIVA 时间: 2014-8-11 13:29

woshishuilz 发表于 2014-8-11 12:49
我看网上说CD25是诱导性表达分子，且表达量不均一，或多或少，荧光信号有强有弱，一般在流式分析分析图上 ...

做出的图应该是这样的啊~同型对照一定要做，尤其是CD25的同型对照。

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-11 14:42

RIVA 发表于 2014-8-11 13:29
做出的图应该是这样的啊~同型对照一定要做，尤其是CD25的同型对照。

嗯，那如果前面FS/SS里面的细胞圈门是全部都圈上，下面直接CD4/CD25纵横坐标分析，还是在总细胞里圈出淋巴细胞下面分析，我做流式的时候那老师直接全部全上，就跟上面的图一样

作者: niwanmao 时间: 2014-8-11 21:06

woshishuilz 发表于 2014-8-11 10:46
只是做了个CD25同性对照，按时间顺序第一个PE

从你这几个图看，首先，细胞状态很差，都碎了，其次没染上。

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-11 21:16

niwanmao 发表于 2014-8-11 21:06
从你这几个图看，首先，细胞状态很差，都碎了，其次没染上。

倪老师麻烦看看我做的步骤对不对：
我做了估计有40多管，都跟这个差不多，我是取大鼠尾静脉抽血后做的全血步骤是这样的：
1、尾静脉采血用EDTA-2K管抗凝后立即检测，
2、分5管：空白管，CD25同型，CD25PE,CD4APC,CD4CD25双染。每管50ul全血样本，每管加
5ulCD4、CD25抗体(杭州联科)。
3、4度孵育20min后加入1ml红细胞裂解液（碧云天），4度10min。
4、时间到后2400min/5min洗涤2次后，600ul的pbs重悬，过300目筛网上机。

作者: niwanmao 时间: 2014-8-11 21:31

woshishuilz 发表于 2014-8-11 21:16
倪老师麻烦看看我做的步骤对不对：
我做了估计有40多管，都跟这个差不多，我是取大鼠尾静脉抽血后做的全 ...

如果你4度孵育，建议30分钟，此外，红细胞裂解液可以尝试一下自配氯化铵裂解液（配方站内找）。
离心速度改为1500转/分试试，洗涤一次。

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-11 22:04

niwanmao 发表于 2014-8-11 21:31
如果你4度孵育，建议30分钟，此外，红细胞裂解液可以尝试一下自配氯化铵裂解液（配方站内找）。
离心速度 ...

那个2400/min。实验室都是通用的，因为那个离心机有点慢，平时传代细胞都用1800/min，我以前试过1200/min，结果细胞都没离下来，还有那个孵育跟裂解红细胞4度和室温有没有区别？

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-11 22:08

niwanmao 发表于 2014-8-11 21:31
如果你4度孵育，建议30分钟，此外，红细胞裂解液可以尝试一下自配氯化铵裂解液（配方站内找）。
离心速度 ...

还有那个自配裂解液调ph值，是直接加上还是要用ph仪器检测下调？

作者: niwanmao 时间: 2014-8-11 22:33

woshishuilz 发表于 2014-8-11 22:08
还有那个自配裂解液调ph值，是直接加上还是要用ph仪器检测下调？

以上只是我的建议，总之，细胞新鲜处理时仍出现大量碎片，肯定实验过程中某个环节出了问题，所以需要耐心的一步步去排查。

自配的裂解液可以用Ph试纸，也可以用Ph计，都行。

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-11 22:37

niwanmao 发表于 2014-8-11 22:33
以上只是我的建议，总之，细胞新鲜处理时仍出现大量碎片，肯定实验过程中某个环节出了问题，所以需要耐心 ...

谢谢倪老师指导，我明天再买2支抗体，过2天在做试试，

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-11 23:14

niwanmao 发表于 2014-8-11 22:33
以上只是我的建议，总之，细胞新鲜处理时仍出现大量碎片，肯定实验过程中某个环节出了问题，所以需要耐心 ...

请问倪老师有没有关于肺泡灌洗液炎性细胞瑞氏染色的形态鉴定方面的知识介绍？

作者: niwanmao 时间: 2014-8-12 20:35

woshishuilz 发表于 2014-8-11 23:14
请问倪老师有没有关于肺泡灌洗液炎性细胞瑞氏染色的形态鉴定方面的知识介绍？ ...

炎症细胞性质鉴定应该流式最拿手啊。

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-12 21:54

niwanmao 发表于 2014-8-12 20:35
炎症细胞性质鉴定应该流式最拿手啊。

啊，我们只是数数肺泡灌洗液里面炎性细胞数目，

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-12 21:55

niwanmao 发表于 2014-8-12 20:35
炎症细胞性质鉴定应该流式最拿手啊。

显微镜下数

作者: niwanmao 时间: 2014-8-12 22:19

woshishuilz 发表于 2014-8-12 21:54
啊，我们只是数数肺泡灌洗液里面炎性细胞数目，

参考本帖：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1565-1-1.html

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-14 20:30

niwanmao 发表于 2014-8-12 22:19
参考本帖：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1565-1-1.html

倪老师请问我一开始做的TREG流式，那个老师把FS/SS内的所有细胞都圈上了，然后分析的，现在结果数据能不能在FS/SS内圈出淋巴细胞然后分析，

作者: niwanmao 时间: 2014-8-14 21:24

woshishuilz 发表于 2014-8-14 20:30
倪老师请问我一开始做的TREG流式，那个老师把FS/SS内的所有细胞都圈上了，然后分析的，现在结果数据能不 ...

有原始流式数据，自己就可以用分析软件重新圈门。

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-14 21:38

niwanmao 发表于 2014-8-14 21:24
有原始流式数据，自己就可以用分析软件重新圈门。

可是根据今天做流式的做法圈门后最后的结果都是那种半截式的，难道我做了几十管一个都没有标记上？还有今天做流式的老师直接上双标的，连调电压、补偿都不要了，可以吗？

作者: niwanmao 时间: 2014-8-14 21:42

woshishuilz 发表于 2014-8-14 21:38
可是根据今天做流式的做法圈门后最后的结果都是那种半截式的，难道我做了几十管一个都没有标记上？还有今 ...

你是不是用C6的，C6是不用调节电压的，补偿可以事后调。

作者: woshishuilz 时间: 2014-8-14 22:00
本帖最后由 woshishuilz 于 2014-8-14 22:01 编辑

niwanmao 发表于 2014-8-14 21:42
你是不是用C6的，C6是不用调节电压的，补偿可以事后调。

就cd4cd25，图分析对不/?

作者: 小灰 时间: 2014-8-15 09:01
CD4是淋巴细胞标志。看你FS/SS的图没有裂红啊，你确定是要做全血？不裂红吗？全血做涂增干扰而已。
裂红后一般也是圈淋巴细胞群来分析的

作者: RIVA 时间: 2014-8-15 15:55

woshishuilz 发表于 2014-8-14 22:00
就cd4cd25，图分析对不/?

分析的挺好的，比之前的好多了，就是FCS的阈值设的太大了~

作者: niwanmao 时间: 2014-8-15 20:20

woshishuilz 发表于 2014-8-14 22:00
就cd4cd25，图分析对不/?

相对来说，最好是圈淋巴细胞群，否则单核细胞的CD4＋可能也会有点干扰分析。

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