流式中文网

标题: 基于红绿荧光分选活细胞置于96孔板中qPCR检测问题 [打印本页]

作者: hyl0810073 时间: 2014-12-5 14:06
标题: 基于红绿荧光分选活细胞置于96孔板中qPCR检测问题
细胞来源于组织消化。是Rosa小鼠，可自发红色荧光。在cre介导下，某些细胞表现为绿色。我的课题需要获得这部分绿色的细胞。基于这个荧光的话进行分选的话有哪些需要注意的，可以提高分选的效率。对于这部分绿色细胞还有的特点是：细胞直径12-17um,细胞核大于红的细胞，DNA含量是4N。（我看到niwanmao版主回复别人问题时提到：红光和绿光之间会有补偿存在，只有调节好补偿就可以分析。补偿值如果能找到单阳性的细胞做补偿参照那是最好，如果没有单阳性，可以根据经验调节。）分选出这部分细胞在将其打入96孔板中，有那些方式可以提高效率。我在群里查了一部分，好像很多这类的问题，高分悬赏，希望在这个问题上可以解决。

作者: hyl0810073 时间: 2014-12-5 14:07
没能上传图片，抱歉了

作者: niwanmao 时间: 2014-12-5 14:23
你在分选时是直接根据红、绿自发荧光分选吗？如果DNA含量可以区分，似乎HOECHST染料应该也可以用吧

作者: hyl0810073 时间: 2014-12-5 14:35

niwanmao 发表于 2014-12-5 14:23
你在分选时是直接根据红、绿自发荧光分选吗？如果DNA含量可以区分，似乎HOECHST染料应该也可以用吧 ...

根据红、绿自发荧光分选的，也和分选的老师说了DNA含量4N，筛选的具体内容我不清楚。但是效率很低。只有2%的绿色细胞

作者: niwanmao 时间: 2014-12-5 14:36

hyl0810073 发表于 2014-12-5 14:35
根据红、绿自发荧光分选的，也和分选的老师说了DNA含量4N，筛选的具体内容我不清楚。但是效率很低。只有2 ...

DNA含量4倍体，如果没有染核酸染料也看不出的，可能只是纯粹根据红绿自发荧光分选。因为没有图，所以不知道当初设门或补偿是不是有问题。有图是最好的了。

作者: hyl0810073 时间: 2014-12-5 14:37

hyl0810073 发表于 2014-12-5 14:35
根据红、绿自发荧光分选的，也和分选的老师说了DNA含量4N，筛选的具体内容我不清楚。但是效率很低。只有2 ...

细胞是生殖细胞，处于减数第一次分裂前期。DNA含量是4N

作者: hyl0810073 时间: 2014-12-5 14:38
等会我取找图

作者: hyl0810073 时间: 2014-12-5 14:46

niwanmao 发表于 2014-12-5 14:36
DNA含量4倍体，如果没有染核酸染料也看不出的，可能只是纯粹根据红绿自发荧光分选。因为没有图，所以不知 ...

我要求的绿色细胞数目不多，能否控制严格一点来使得绿色细胞更加纯净一点。

作者: niwanmao 时间: 2014-12-5 14:47

hyl0810073 发表于 2014-12-5 14:46
我要求的绿色细胞数目不多，能否控制严格一点来使得绿色细胞更加纯净一点。 ...

所以我觉得还是得看当时分选的图。可能没圈对，2％实在太低了。

作者: hyl0810073 时间: 2014-12-5 14:48

niwanmao 发表于 2014-12-5 14:36
DNA含量4倍体，如果没有染核酸染料也看不出的，可能只是纯粹根据红绿自发荧光分选。因为没有图，所以不知 ...

细胞核的直径比一般细胞的要大很多。能根据这个再设定一直门控吗

作者: niwanmao 时间: 2014-12-5 15:01

hyl0810073 发表于 2014-12-5 14:48
细胞核的直径比一般细胞的要大很多。能根据这个再设定一直门控吗

可以。

作者: 月下听蝉 时间: 2014-12-30 00:32
如果是用561激发来检测红光，基本不需要再调补偿。如果是488的，就得调一下。
绿光跟4N是特性，最好绿光跟HOECHST同时检测，保证阳性率，再分选到96孔板。
如果细胞数很少，就先开enrich富集，富集后再开single cell分到96孔板。96孔板如果做single cell单孔的话，分完必须马上用掉。多个的话，也最好尽快使用，流式反复处理对细胞多少会有损伤的。

欢迎光临流式中文网 (https://www.flowcyto.cn/bbs/)