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标题: foxp3染色问题求助 [打印本页]

作者: librahui 时间: 2016-1-8 20:32
标题: foxp3染色问题求助
昨天做了Treg细胞的检测，是人外周血做的，但foxp3标记不上，不知道什么原因，向大家请教。
具体步骤是：1.100ul全血+2.5ulCD3+2.5ulCD8+5ulCD25 室温30min
                  2.每管1ml溶血素室温10min，离心然后染色缓冲液洗一次
                  3.每管1ml新鲜配置的fix/perm（1：3配置ebioscience）室温60min
                  4.之后加破膜buffer2ml 洗两次
                  5.加100ul破膜buffer重悬细胞之后加foxp3抗体5ul，室温60min
                  6.破膜buffer2ml洗一次，染色缓冲液2ml洗一次，加500ul染色缓冲液重悬上机
三张图分别是全血，CD3+CD8+CD25同型foxp3同型，全阳管，但感觉foxp3没染上，不知道什么原因，因为也一起做Th17，同样用的是foxp3的破膜剂，结果一直很好，但不知道为什么foxp3标不上，不知道是破膜原因还是抗体的问题。

作者: niwanmao 时间: 2016-1-9 20:43
全血那管是什么抗体都没加吗？全阴的。

foxP3很难稳定，关键还是在破膜剂，Th17之所以能做出来，因为IL17在胞内，不像foxP3在核内。不过抗体原因也不能完全排除。

作者: librahui 时间: 2016-1-10 10:30
是的，全血没有加抗体，那倪老师，我是需要把破膜时间延长吗，我就是怕核膜比较难破，平时都是45min，现在用一个小时，还有温度有没有影响，我是室温破的。@niwanmao

作者: niwanmao 时间: 2016-1-11 19:21

librahui 发表于 2016-1-10 10:30
是的，全血没有加抗体，那倪老师，我是需要把破膜时间延长吗，我就是怕核膜比较难破，平时都是45min，现在 ...

你买的破膜剂确定能破核膜？

作者: librahui 时间: 2016-1-12 08:26

niwanmao 发表于 2016-1-11 19:21
你买的破膜剂确定能破核膜？

是滴，是ebi专用的破核膜一共3瓶，我昨天还试着把破膜时间延长至1.5h，但仍是标记不上foxp3，不知道什么原因，急死了

作者: 缺血再灌注损伤 时间: 2016-1-12 10:44
会不会是抗体的问题，你问问实验室别人用这个抗体有染上的吗？

作者: 大头 时间: 2016-1-12 15:19
我们实验室一直用的是ebioscience的破膜盒子，能染上，而且破膜时间没有这么长

作者: librahui 时间: 2016-1-12 16:43

大头发表于 2016-1-12 15:19
我们实验室一直用的是ebioscience的破膜盒子，能染上，而且破膜时间没有这么长 ...

亲你是PBMC做的，还是全血做的，我是全血做的，做不出来

作者: niwanmao 时间: 2016-1-12 20:27

librahui 发表于 2016-1-12 08:26
是滴，是ebi专用的破核膜一共3瓶，我昨天还试着把破膜时间延长至1.5h，但仍是标记不上foxp3，不知道什么 ...

如果能够确定破膜剂没有问题，那么需要排除抗体问题。记得前段时间有个研究生做BrdU遇到类似的情况，用了某怎么品牌抗体，无论如何都做不出来，后来换了个名不见经传的牌子，反而做出了漂亮的图形。

作者: librahui 时间: 2016-1-13 07:48

niwanmao 发表于 2016-1-12 20:27
如果能够确定破膜剂没有问题，那么需要排除抗体问题。记得前段时间有个研究生做BrdU遇到类似的情况，用了 ...

恩恩谢谢老师，现在正在和试剂商沟通

作者: 大头 时间: 2016-1-13 08:41

librahui 发表于 2016-1-12 16:43
亲你是PBMC做的，还是全血做的，我是全血做的，做不出来

我们是脾脏和淋巴结，效果很好
全血裂红后做的，FOXP3能染上，但CD25染得效果不是很好

作者: librahui 时间: 2016-1-13 11:08

大头发表于 2016-1-13 08:41
我们是脾脏和淋巴结，效果很好
全血裂红后做的，FOXP3能染上，但CD25染得效果不是很好 ...

那亲你用的溶血素是哪个厂家的，我用的是BD的，ebi的技术说含固定成分，让我换成不含甲醛的溶血素，现在就是在排除问题，好纠结

作者: 大头 时间: 2016-1-13 13:45

librahui 发表于 2016-1-13 11:08
那亲你用的溶血素是哪个厂家的，我用的是BD的，ebi的技术说含固定成分，让我换成不含甲醛的溶血素，现在 ...

我们就是自己配的红细胞裂解液，就是网上普通的配方

作者: stem_cells 时间: 2016-1-14 13:59

librahui 发表于 2016-1-13 07:48
恩恩谢谢老师，现在正在和试剂商沟通

做Foxp3可以尝试一下分PBMC做，我们试过全血做不出来，但是分PBMC以后可以染出来。

作者: 奇天 时间: 2016-8-30 15:40
那种FIX和perm放在一起的试剂不好用，也不知道是FIX和perm放在一起的原因，还是之后步骤的perm不好用。后来我换了FIX和perm分开的试剂盒，这个就很好用，避嫌做广告，具体的自己搜吧

作者: niwanmao 时间: 2016-8-30 17:54

奇天发表于 2016-8-30 15:40
那种FIX和perm放在一起的试剂不好用，也不知道是FIX和perm放在一起的原因，还是之后步骤的perm不好用。后来 ...

应该不是这个原因，可能跟破膜成份有关，有些破膜剂只能破胞膜，而foxP3需要破核膜。

作者: 奇天 时间: 2016-9-22 09:19

niwanmao 发表于 2016-8-30 17:54
应该不是这个原因，可能跟破膜成份有关，有些破膜剂只能破胞膜，而foxP3需要破核膜。 ...

是我理解偏了
FIX和prem放在一起的那种试剂盒说明书破膜时间短，反正不是过夜，对比了一下，过夜的方式是对的，说明书是错的，还有一处错误：加入Foxp3孵育后进行清洗时用的是staining buffer，而不是用perm洗。
我用的FIX和perm分开的那种是破细胞膜的，如果先把细胞冻存，染色效果就会好些，应该是DMSO起到了破膜的作用。我最近把FIX和perm一起加入过夜，发现不冻存细胞也能染上颜色，效果会好很多，这是在流式中文网得到的启示。请问倪老师，1、FOX3是不是连续表达；2：这两种perm的成分一样吗，如果不一样，是不是能破核膜的prem更强一些。

作者: niwanmao 时间: 2016-9-22 10:27

奇天发表于 2016-9-22 09:19
是我理解偏了
FIX和prem放在一起的那种试剂盒说明书破膜时间短，反正不是过夜，对比了一下，过夜的方式是 ...

我不知道你用的是什么品牌，什么批号的试剂盒。至于你这里说的冻存后染的好，这应该不会是DMSO作用，DMSO是保护细胞的，而是冻存本身的作用，冻存本身对细胞膜有影响。

你问的foxP3是否连续表达指什么意思？指染色的时候他们继续还在表达出来？
不同商品的破膜剂成份可能一样，也可能不一样，看厂家那边能否查到成份了。

作者: 奇天 时间: 2016-9-22 16:34
倪老师帮看看这个说明书是不是有问题

关于Foxp3的连续表达：我的意思是Foxp3在分群的时候是不是很清晰，是不是分的很开，如果有Foxp3和CD25双阳的标准图，发个看看呗

作者: 她说加油JJ 时间: 2016-9-22 18:21
你好，我想请教您做TH17的具体方法，我是提PBMC后培养刺激，染CD4 IL-17效果一直不理想，CD4分群不好，IL-17没表达，各种问题。想咨询您一些TH17具体的方法步骤，谢谢。你是CD3CD8标记还是CD4啊？

作者: niwanmao 时间: 2016-9-22 19:36

奇天发表于 2016-9-22 16:34
倪老师帮看看这个说明书是不是有问题

我们在临床上用CD4、CD25、CCR4、CD127来圈Treg的，所以我自己没有foxP3的图，但是给研究生做过一些，确实分群还不错的，就像下面这幅eBioscience网站上的图那样。说明书的步骤应该还好啊，你觉得哪里问题？
[attach]10957[/attach]

作者: niwanmao 时间: 2016-9-22 19:37

她说加油JJ 发表于 2016-9-22 18:21
你好，我想请教您做TH17的具体方法，我是提PBMC后培养刺激，染CD4 IL-17效果一直不理想，CD4分群不好，IL-1 ...

CD4需要破胞内或者用Quin2 AM阻止CD4下调：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4750-1-1.html

IL-17染不好，我觉得需要从破膜效果、抗体两方面进行依次排除。

作者: 奇天 时间: 2016-9-23 09:07

niwanmao 发表于 2016-9-22 19:36
我们在临床上用CD4、CD25、CCR4、CD127来圈Treg的，所以我自己没有foxP3的图，但是给研究生做过一些，确 ...

我发的图片的说明书中加入FIX/perm后孵育的时间太短了，只有20分钟，之后又用staining buffer（没有透明功能）洗了一遍，随然之后又用prem洗了一遍，并且又加perm孵育了15min，但是我觉得时间还是短，按照这个说明书做过，效果不好。还有加foxp3只孵育了30min。这些和下面帖子中的方法不一样，下面的孵育过夜，染色前后不用staining buffer洗，foxp3孵育时间2小时
小鼠Treg，加入foxp3后，所有群体都往foxp3阳性方向移动
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4146-1-1.html
(出处: 流式中文网)

作者: niwanmao 时间: 2016-9-23 16:25

奇天发表于 2016-9-23 09:07
我发的图片的说明书中加入FIX/perm后孵育的时间太短了，只有20分钟，之后又用staining buffer（没有透明 ...

效果好的破膜剂一般30分钟～60分钟足够了。

作者: xuexi-ing 时间: 2019-12-19 19:27
您好，应该是抗体的问题吧，我们这边用的也是eBi的，固定破膜分别30min即可
另外我想请教一下您的Th17是指IL-17吗？这个你需要刺激吗？还是胞内操作直接就能染出来？

作者: niwanmao 时间: 2019-12-19 20:14

xuexi-ing 发表于 2019-12-19 19:27
您好，应该是抗体的问题吧，我们这边用的也是eBi的，固定破膜分别30min即可
另外我想请教一下您的Th17是指I ...

准确的说，Th17指的是细胞，IL-17A指的是细胞因子。通过染胞内细胞因子IL-17A可区分出Th17，这样说才比较正规。
需要刺激！！！！

作者: xuexi-ing 时间: 2019-12-20 09:04

niwanmao 发表于 2019-12-19 20:14
准确的说，Th17指的是细胞，IL-17A指的是细胞因子。通过染胞内细胞因子IL-17A可区分出Th17，这样说才比较 ...

好的，谢谢倪老师解答

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