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标题: Annexin V+/PI双染用流式细胞仪做活性污泥生物膜的凋亡 [打印本页]

作者: 李昆13579 时间: 2016-7-23 16:31
标题: Annexin V+/PI双染用流式细胞仪做活性污泥生物膜的凋亡
本人新手，请问大虾和老师：能用Annexin V+/PI对活性污泥中的细菌或者藻类（单细胞）进行双染，用流式细胞仪来检测细菌的凋亡吗？这种混合杂菌型的实验用流式细胞仪做凋亡有没有可行性？如果可行怎么操作？注意事项有哪些？本人第一次接触流式细胞仪好像都是测定纯细胞的凋亡的，所以完全不懂，望见谅。。。谢谢答复

作者: kuzhierran 时间: 2016-7-23 16:31
另外，刚刚看文献，细菌有用AnnexinV-PI双染检测凋亡的，可参考《纳米银抗菌作用机制：剂量依赖性促进细菌凋亡》
我把方法给你直接贴一下，和我们平时做动物细胞的protocol差不多：

流式细胞术检测大肠杆菌凋亡：取过夜摇的大肠杆菌菌液，1∶100转接于LB液体培养基中，实验组分别加入5，10 mg/L纳米银溶液，对照组不加纳米银溶液，37 ℃、220 r/min摇菌1，3 h，每隔1 h取菌液，离心取沉淀，100 μL × Annexin V-binding buffer重悬沉淀后，加入5 μL FITC-Annexin V和2 μL PI染液，室温避光孵育15 min，最后加入400 μL 1×Annexin V-binding buffer，流式细胞仪检测分析。

作者: niwanmao 时间: 2016-7-24 21:35
细菌好像没看到谁测过Annexin V 的凋亡，都是用核酸染色区分死活。
至于藻类，植物类的细胞壁结构应该也染不了Annexin V吧？

你可以找一下你们这个专业的相关文献，参考一下其它人的检测方法，至于要将两种细胞分开来的话，需要有能够区分两者的标记，也可以是细胞大小和颗粒度。

作者: lilifirst 时间: 2016-7-25 19:23
植物可以做凋亡，但是要先用果胶酶去除细胞壁

作者: niwanmao 时间: 2016-7-25 19:40

lilifirst 发表于 2016-7-25 19:23
植物可以做凋亡，但是要先用果胶酶去除细胞壁

可否提供较为详细的步骤？这确实是我们没有接触过的。

作者: 李昆13579 时间: 2016-7-27 20:36
谢谢老师的回复，是呀，像藻类这种有细胞壁的微生物如何做凋亡呢？@lilifirst

作者: 李昆13579 时间: 2016-7-27 20:45
@lilifirst您有做过像这类有细胞壁或者单细胞的微生物直接做细胞凋亡实验的？谢谢大神答复呀！！！

作者: kuzhierran 时间: 2016-7-28 00:09
浮游生物可以检测caspase-likeprotease，可参考文献《浮游植物细胞程序化死亡研究进展》张秀芳，刘永健。
植物的话检测方法很多，像版主说的，一般都是用DNA染色后，可以通过流式检测，可以查查看是否可以平移到单细胞藻类应用
1. 凋亡细胞经乙醇固定、低渗打洞、PI 染色后, 用流式细胞仪检测荧光标记的DNA 含量(同周期检测）。亚二倍体峰即凋亡。优点：可定量、灵敏度高；缺点：无法观察S和G2的细胞凋亡。
2. 7add染色，阴性（正常细胞）、弱阳性（凋亡细胞）、阳性（死亡细胞）
3. AO染色，核酸内切酶活性指示剂，AO 染色的细胞经流式细胞仪分析, 红色荧光表示AO 与单链DNA 反应, 绿色荧光表示AO 与双链DNA反应。亦可未固定活细胞与EB双染。
4. Hoechest33342 染色法，较高的红/蓝比表示染色质浓缩和DNA片段化，即凋亡细胞。
5. Hoechest33342 可与PI、MC540双染，亦可与PI、SDH三重染色

希望能给你做个参考

作者: lilifirst 时间: 2016-7-28 09:36
上边我们同事解答了大肠杆菌凋亡的操作步骤。以下是植物做细胞凋亡的方法：
(1)去掉细胞壁提取原生质。
(2)用protoplast washing buffer（5mmol/L MES,0.2mmol/L sorbitol,0.2mmol/L manitol.pH5.8）洗两次原生质，重悬原生质到 100ul binding buffer，密度调节到5X105/ml，加annexin V 避光孵育15min，加PI染色，再加400ul binding buffer。
(3)流式检测。具体可以参照附件文献。
再就是需要注意的一点就是藻类含有比较多的细胞色素（如藻红蛋白），我不了解你的待测藻中含有哪种色素，这个需要在调节补偿和选择annexin V标记时要综合考虑。我们公司北京四正柏生物科技有限公司（http://www.4abio.com/）自主研发了多种annexin V/PI凋亡试剂盒可供选择，如果试剂选择和实验方案上有什么问题我们可以共同探讨 QQ：2881004861

作者: 李昆13579 时间: 2016-7-28 09:51

lilifirst 发表于 2016-7-28 09:36
上边我们同事解答了大肠杆菌凋亡的操作步骤。以下是植物做细胞凋亡的方法：
(1)去掉细胞壁提取原生质。
(2) ...

谢谢大神们的详细回复，确实对我帮助不少。我好好看看

作者: 李昆13579 时间: 2016-7-28 09:52

niwanmao 发表于 2016-7-24 21:35
细菌好像没看到谁测过Annexin V 的凋亡，都是用核酸染色区分死活。
至于藻类，植物类的细胞壁结构应该也染 ...

也谢谢老师的回复。

作者: 李昆13579 时间: 2016-7-28 09:54

niwanmao 发表于 2016-7-24 21:35
细菌好像没看到谁测过Annexin V 的凋亡，都是用核酸染色区分死活。
至于藻类，植物类的细胞壁结构应该也染 ...

谢谢老师的及时回复

作者: 李昆13579 时间: 2016-7-28 11:38

lilifirst 发表于 2016-7-28 09:36
上边我们同事解答了大肠杆菌凋亡的操作步骤。以下是植物做细胞凋亡的方法：
(1)去掉细胞壁提取原生质。
(2) ...

老师：有用染料 SYTOX-Green或者SYBRgreenⅠ( SYBR)方法直接染色有细胞壁的藻类，怎么解释呢？是两种染料能直接通过细胞壁而检测细胞膜的通透性来检测细胞的死亡情况吗？那么这样一来不就有无细胞壁无所谓了吗？就不用除去细胞壁了吗？
文章：Flow cytometric analysis of phytoplankton viability following viral infection
摘要：
Two flow cytometric assays using physiological probes were used on the phytoplankton species Phaeocystis pouchetii and Micromonas pusilla to examine the assays' utility in detecting viral infections. Dead cells were detected using the membrane impermeant nucleic-acid dye SYTOX-Green, which stains algal cells that have lost their membrane integrity. Live cells were detected using the membrane permeant dye Calcein-AM, which is hydrolyzed by intracellular esterases into a green fluorescent charged form. We found that both assays are easy to use, are reproducible and can indeed be used as markers of the viability of individual phytoplankton cells following infection by viruses. Cell death rates up to 0.8 d

作者: kuzhierran 时间: 2016-7-29 00:04

李昆13579 发表于 2016-7-28 11:38
老师：有用染料 SYTOX-Green或者SYBRgreenⅠ( SYBR)方法直接染色有细胞壁的藻类，怎么解释呢？是两种染料 ...

是的，这两种染料都可以直接穿透细胞壁，选择性（细胞死活）穿透细胞膜。

AnnexinV的原理不同，是通过结合凋亡过程中，由细胞膜脂双层内层外翻到细胞表面的磷脂酰丝氨酸检测的。

作者: 李昆13579 时间: 2016-7-29 11:34

kuzhierran 发表于 2016-7-29 00:04
是的，这两种染料都可以直接穿透细胞壁，选择性（细胞死活）穿透细胞膜。

AnnexinV的原理不同，是通过结 ...

那么请问老师：The live/dead staining（SYTO® 9 和PI两种和核酸染料双染后能上流式细胞仪检测吗），也就是说 SYTOX-Green或者SYBRgreenⅠ( SYBR)也是核酸染料吧

作者: kuzhierran 时间: 2016-7-29 13:46
本帖最后由 kuzhierran 于 2016-7-29 14:14 编辑

都是核酸染料，SYTOX-Green当然可以通过流式检测，设置可以按照FITC来设置
请参考：http://www.thermofisher.com/cn/z ... ox-green-stain.html

另外分享一个PPT给你，我觉得其中很多实验你可以借鉴。我这边网速受限，上传实在太慢了，你自己下载吧，百度文库0下载券:)

流式细胞仪在水生生物研究中的应用

http://wenku.baidu.com/link?url= ... HJ_2A0lVlGzbpakoFu_

作者: niwanmao 时间: 2016-7-29 19:51

李昆13579 发表于 2016-7-29 11:34
那么请问老师：The live/dead staining（SYTO® 9 和PI两种和核酸染料双染后能上流式细胞仪检测吗），也 ...

今天翻论坛帖子，发现其实很早以前发过测污泥微生物的PDF：http://www.flowcyto.cn/bbs/reade ... Ja98EYtBXZlfXej3AR4

作者: 李昆13579 时间: 2016-7-30 10:23

niwanmao 发表于 2016-7-29 19:51
今天翻论坛帖子，发现其实很早以前发过测污泥微生物的PDF：http://www.flowcyto.cn/bbs/reader.php?mod=f ...

谢谢老师提供的资料

作者: 李昆13579 时间: 2016-7-30 10:24
谢谢老师

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