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标题: 曾有如此强大的免费流式分析软件Flowing [打印本页]

作者: niwanmao 时间: 2018-6-15 10:58
标题: 曾有如此强大的免费流式分析软件Flowing
无论是在论坛上，还是在线下，常会有人问破解版FlowJo或破解版××哪里可以下载？可能商业软件的宣传比较深入人心吧。但是我真想说一句，有一个5年前出品的免费流式分析软件——Flowing，尽管5年未更新，但是其中的功能对于95％以上的人足够用，更值得一提的是，其中有几个功能商业软件都没做得这么贴心或者根本就没有。

这个软件是由芬兰的Perttu Terho等人开发，采用流程图方式分析，特色十足且清晰。
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今天，我就稍微挑几个大家常用的、急需的功能用这个软件演示一下。

1、普通的散点图和密度图、设门相关
软件的分析流程和其它软件略有不同，需要先利用Visualization Tools下面的Plot或Histogram先绘制出图框（可绘制普通散点图，也可绘制密度图、直方图、叠加直方图，叠加直方图后面讲），再选择FCS文件（LMD文件也支持，但是我测试发现，大的LMD文件容易出错，所以还是建议优先用FCS文件）。
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更改坐标参数，和其它软件类似，都是在坐标上鼠标右键选择。设门，则是在图上空白区域点鼠标右键，选择Create new Region，至于门的名称、颜色、逻辑组合、删除，都是在右侧Populations窗口鼠标右键执行，这些功能我觉得比Flowjo好用，尤其是逻辑组合：
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2、散点图细胞太多，看不清，想少显示一些
对于获取稀有事件的朋友，会获取百万级别的细胞，此时，细胞群之间的分界就看不清楚，为此，就需减少显示的细胞数量，以便圈门。
Flowjo有这功能，Kaluza直到新的2.0版本才具备此功能，而Flowing在5年前就具备了此功能，而且其选择数据的功能十分多样。
在菜单中，选择Data Reduction Tools下面的Reduce Event Number：
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会在主界面出现一个空白框Event Number Reducer：
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选中该框，选择FCS文件后，然后鼠标右键选择减少事件的方法，可选择固定的数量，也可选择百分比，可选择从文件头取，也可以按照隔行取事件，最后将这个Event Number Reducer与散点图连接，即可显示数量减少后的图形：
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3、特色：让直方图的门自动微调
不同数据文件之间，如果两个峰比较明显，但是其分群位置略有变动，大家经常需要自己去手动调，少许几个文件还好说，如果上百个数据一个个去调，要累死人的。
Flowing就有自动微调功能，不知道是否孤陋寡闻，这个功能我觉得还是非常特色的，很少有软件有此功能。

首先画一个Histogram，然后在上面分别画阳性峰和阴性峰的Region，这一步一定要做：
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接着，从菜单Create→Region Control Tools下选择move Regions over Negative and Positive Populations：
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将图形与该功能框连接后，默认是显示Non Active的：
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鼠标右键点击该框，选择Active Control即可：
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至于其中自动调整的算法，有三种算法可选，大多数用第一种，如果峰的分隔不是特别好或第一种调坏了，你可选择后面两种：
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接下来用菜单中的Next file in directory或快捷键Ctrl＋N切换到下一个文件：
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看下图的效果：
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4、补偿调节
Flowing的补偿调节虽然没有商业软件可视化拖动滑动条那么简单，但相对来说，也算是比较清晰容易了。
首先选择Create→Data modification tools下面的Compensate Data功能：
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出现一个空白框，将该框与已选择FCS文件的散点图连接（注意箭头朝向），然后按照下图的数字标识依次进行操作：Edit modifications→窗口中选择调节补偿的参数，Remove第一个参数 From第二个参数→点击Save之后，调整Spillover值，就可以看到散点图上的图形补偿发生了变化：
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5、直方图叠加
选择Create→Visualization Tools下的Overlay Histogram：
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接着将其它多个直方图与此框连接（箭头指向此框），即可完成叠加，但是坐标要求名称一致：
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这里有FLOWER要问了，我要给直方图加上颜色，好办，只要给那两个普通的直方图加上颜色，叠加直方图也会自动显示透明色的：
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6、批量处理和统计
商业软件的批处理都有做进去，Flowing的批处理也一点不逊色。
例如我要统计某个抗原表达率，逐级设门后，最后选择抗原表达的直方图或散点图，鼠标右键菜单中选Create Statistics ，就会出现Statistics框，将常见参数都显示出来了，这只是第一步，接下来在Statistics框上再点击鼠标右键，选择Create StatList，接下来，只需在散点图或直方图上，按Ctrl＋N或Ctrl＋P前后切换数据，就会看到StatList上不断有数据添加上去，最后只需复制StatList上的数据即可。
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更多视频介绍
如果需要更详细的、更高清的视频教程，在官方网站上有wmv格式的视频教程下载：http://flowingsoftware.btk.fi/index.php?page=4，不过网速可能偏慢。

安装
软件需要.net framework 3.5支持，需从微软网站下载：http://www.microsoft.com/zh-cn/download/details.aspx?id=21 flowing官方网站的下载程序由于为clickonce发布的，故安装时会默认安装至c:\temp，容易被误删，故我将该目录下的程序提取并改名打包，上传于此，大家可在.net framework 3.5安装完成后直接解压缩运行：点此下载Flowing简洁压缩包，解压即可用

现在，你还要去找商业软件的话，我就无奈了

作者: 路西法 时间: 2018-6-19 09:43
您好，我请教个疑问，我看到视频里图片可以自动粘贴到一起，就是creat-collection tools-Image collector（well plate）这个工具，要怎样让所有的图都显示出来？我的是选择散点图按ctrl +N/ctrl+P后一张图片前后切换，不会所有的图平铺起来。
谢谢

作者: niwanmao 时间: 2018-6-19 20:36

路西法发表于 2018-6-19 09:43
您好，我请教个疑问，我看到视频里图片可以自动粘贴到一起，就是creat-collection tools-Image collector（ ...

你指的是Image Collector的功能，可参见视频：http://flowingsoftware.btk.fi/object_help/08-imagecollector.wmv

作者: 3333 时间: 2018-6-22 18:12
有立体图吗

作者: liushixibao 时间: 2018-6-27 10:05
汉化一下就好了，哈哈

作者: niwanmao 时间: 2018-6-27 17:49

liushixibao 发表于 2018-6-27 10:05
汉化一下就好了，哈哈

这么难的流式都能学会，这么简单的菜单英文能难得住你？

作者: wilsay@126.com 时间: 2018-7-24 15:13
倪老师，我用flowing怎么打不开FCS文件呢？每次点击时总提示说文件格式不是FCS，可我存的确实是

作者: niwanmao 时间: 2018-7-24 22:09

wilsay@126.com 发表于 2018-7-24 15:13
倪老师，我用flowing怎么打不开FCS文件呢？每次点击时总提示说文件格式不是FCS，可我存的确实是 ...

你仔细看使用步骤，肯定是使用步骤不对。Flowing是先画图，然后再选中图以后打开FCS

作者: bingbingyan0714 时间: 2019-1-25 12:15
本帖最后由 bingbingyan0714 于 2019-1-25 12:17 编辑

倪老师，我在用这个软件调节补偿的时候，进行到Remove第一个参数 From第二个参数→点击Save之后，就成下面这个样子了，不能调整Spillover值啊，这是怎么回事？@niwanmao

作者: bingbingyan0714 时间: 2019-1-25 12:17
@niwanmao 先1操作完save就成2了

作者: niwanmao 时间: 2019-1-27 10:32

bingbingyan0714 发表于 2019-1-25 12:15
倪老师，我在用这个软件调节补偿的时候，进行到Remove第一个参数 From第二个参数→点击Save之后，就成下面 ...

在Spillover框内输入一个数字，回车确认，然后再Save

作者: mkcc 时间: 2019-1-28 21:50
倪老师，感谢分享！我用该软件时发现：如果在diva等软件中，对Parameter的名字进行了更改，如把FITC通道改成CD8，那么相应通道的补偿在Flowing软件就读不出来，不知是什么原因呢？

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作者: niwanmao 时间: 2019-1-29 10:15

mkcc 发表于 2019-1-28 21:50
倪老师，感谢分享！我用该软件时发现：如果在diva等软件中，对Parameter的名字进行了更改，如把FITC通道改 ...

Diva如果修改了Parameter名称，往往导出FCS文件时仍然还是原来的名称。这应该是Diva软件的Bug。

作者: zjjxqsm2008 时间: 2019-2-22 14:26
倪老师，请问mac有没有免费的流式处理软件呢？

作者: niwanmao 时间: 2019-2-22 18:51

zjjxqsm2008 发表于 2019-2-22 14:26
倪老师，请问mac有没有免费的流式处理软件呢？

Mac可以用我们汉化过的流式分析助手（首页上也有链接的），只需要安装好Java运行环境即可。

作者: zjjxqsm2008 时间: 2019-2-22 23:24

niwanmao 发表于 2019-2-22 18:51
Mac可以用我们汉化过的流式分析助手（首页上也有链接的），只需要安装好Java运行环境即可。 ...

非常感谢！

作者: 蒋佳焕 时间: 2019-3-29 12:27
ni老师，这个软件可以分析CytoFLEX机器出来的FCS文件吗？
我用mac破解版的FlowJo打开CytoFLEX的FCS文件就会崩溃

作者: niwanmao 时间: 2019-3-30 11:19

蒋佳焕发表于 2019-3-29 12:27
ni老师，这个软件可以分析CytoFLEX机器出来的FCS文件吗？
我用mac破解版的FlowJo打开CytoFLEX的FCS文件就会 ...

cytoflex导出的fcs文件有点特殊，连beckman自家的kaluza一开始也兼容不好（最近可能有所改善）。所以建议尽量用自带的cytexpert吧。

作者: malizewski 时间: 2019-4-19 12:41
flowing这个软件可以设置time轴，是否可以分析荧光信号随时间变化？比如检测胞内钙离子？

作者: niwanmao 时间: 2019-4-21 10:49

malizewski 发表于 2019-4-19 12:41
flowing这个软件可以设置time轴，是否可以分析荧光信号随时间变化？比如检测胞内钙离子？ ...

只要仪器获取的时候，没把TIME参数取消掉，就能分析。这不是软件的功能之一，而是仪器获取时的参数设置问题。
一般如果没有特别设置过，TIME参数每台机器都有的，那么软件都是可以分析的。

作者: 甘芝草莓 时间: 2019-4-21 16:37

wilsay@126.com 发表于 2018-7-24 15:13
倪老师，我用flowing怎么打不开FCS文件呢？每次点击时总提示说文件格式不是FCS，可我存的确实是 ...

BD Accuri™ C6导出的FCS文件也打不开。Flowing software网站上说识别2.0和3.0版本，BD网站上说导出的是3.1版本的。不知道是不是这个原因，所以识别不了。

作者: niwanmao 时间: 2019-4-21 20:59

甘芝草莓发表于 2019-4-21 16:37
BD Accuri™ C6导出的FCS文件也打不开。Flowing software网站上说识别2.0和3.0版本，BD网站上说导出的是3 ...

一个是FCS版本，另一个原因是C6、CytoFLEX等小型机都往文件里面加上了一些自己的特殊字段，导致软件无法解析。

作者: malizewski 时间: 2019-4-22 12:30

niwanmao 发表于 2019-4-21 10:49
只要仪器获取的时候，没把TIME参数取消掉，就能分析。这不是软件的功能之一，而是仪器获取时的参数设置问 ...

感谢倪老师！我分析胞内钙离子随时间变化，以time为横轴，以FITC/PerCP-cy5.5为纵轴，发现数据都集中在接近原点处，是因为横轴和纵轴刻度没有调吗？图上横纵轴的刻度都超过1000了

作者: niwanmao 时间: 2019-4-22 20:35

malizewski 发表于 2019-4-22 12:30
感谢倪老师！我分析胞内钙离子随时间变化，以time为横轴，以FITC/PerCP-cy5.5为纵轴，发现数据都集中在接 ...

不是很理解。

作者: malizewski 时间: 2019-4-23 16:45
本帖最后由 malizewski 于 2019-4-23 16:47 编辑

倪老师，纵轴是FITC/PerCP-cy5.5，横轴是time，但是数据都集中在原点那里了，不知怎么拉开？谢谢

作者: niwanmao 时间: 2019-4-23 22:45

malizewski 发表于 2019-4-23 16:45
倪老师，纵轴是FITC/PerCP-cy5.5，横轴是time，但是数据都集中在原点那里了，不知怎么拉开？谢谢 ...

按照下面4幅图操作，产生出一个新的TIME坐标，即可。

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作者: malizewski 时间: 2019-4-24 16:55
倪老师，非常感谢！我想要做成一根平滑的曲线（纵轴是FITC/PerCP-cy5.5，横轴是time），能否做成像flowjo里面kinetics功能那样的图呢？我看到flowing有公式计算的功能，如果可以有函数功能比如直接计算median也许就行了，但是似乎只有简单的加减乘除？

作者: niwanmao 时间: 2019-4-26 08:27

malizewski 发表于 2019-4-24 16:55
倪老师，非常感谢！我想要做成一根平滑的曲线（纵轴是FITC/PerCP-cy5.5，横轴是time），能否做成像flowjo里 ...

可以把TIME图按时间段圈多个矩形门，然后计算每个时间段矩形门内的Y轴Median就行了，参考：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6195-1-1.html 分析方法

作者: lxk47640 时间: 2019-7-2 21:27

niwanmao 发表于 2018-7-24 22:09
你仔细看使用步骤，肯定是使用步骤不对。Flowing是先画图，然后再选中图以后打开FCS ...

倪老师，x和y坐标轴大小范围怎么调？

作者: niwanmao 时间: 2019-7-3 11:21

lxk47640 发表于 2019-7-2 21:27
倪老师，x和y坐标轴大小范围怎么调？

Flowing好像没法调

作者: 特勒兮兮 时间: 2019-10-15 15:40
倪老师，我快绝望了，从CantoII上面拷下来的文件，在flowjo上不能调补偿，自带的DIVA的软件下载了又只能装在XP系统上，flowing短时间还搞不明白，比如说已经GATE出了P1门然后怎么才能再从P1门里分析数据

作者: niwanmao 时间: 2019-10-15 16:19

特勒兮兮发表于 2019-10-15 15:40
倪老师，我快绝望了，从CantoII上面拷下来的文件，在flowjo上不能调补偿，自带的DIVA的软件下载了又只能装 ...

再绘制一个散点图，然后拖动图下的红色块把两个图连接起来，详见顶部的图文教程。

作者: 特勒兮兮 时间: 2019-10-15 17:02

niwanmao 发表于 2019-10-15 16:19
再绘制一个散点图，然后拖动图下的红色块把两个图连接起来，详见顶部的图文教程。 ...

有没有能装在Win10系统的Divas软件

作者: niwanmao 时间: 2019-10-15 22:05

特勒兮兮发表于 2019-10-15 17:02
有没有能装在Win10系统的Divas软件

Diva8可以啊，但是需要加密狗：）

跟Diva相比，Flowing并不差，你可能只是没适应这个操作。

作者: zhang4083 时间: 2019-11-11 16:10
什么我下载完这个，不好使呢？打不开LMD文件。

作者: niwanmao 时间: 2019-11-12 14:01

zhang4083 发表于 2019-11-11 16:10
什么我下载完这个，不好使呢？打不开LMD文件。

先画dotplot，然后再选FCS或LMD文件。

作者: 咸鱼小姐姐 时间: 2019-12-16 09:41
老师您好。我按您给的方法对直方图进行叠加。出现以下几个问题。1.散点图圈门不同，但显示的颜色相同；2.直方图分别设置颜色后都不显示；3.叠加图视觉上不是两个图的叠加，而且与flowjo做出的图不一样。感谢倪老师每次的耐心解答

作者: niwanmao 时间: 2019-12-16 16:02

咸鱼小姐姐发表于 2019-12-16 09:41
老师您好。我按您给的方法对直方图进行叠加。出现以下几个问题。1.散点图圈门不同，但显示的颜色相同；2.直 ...

FlowJO那个图里面，两个直方图是不是未设门？因为左侧蛮多信号拖尾的。

作者: 咸鱼小姐姐 时间: 2019-12-17 09:49

niwanmao 发表于 2019-12-16 16:02
FlowJO那个图里面，两个直方图是不是未设门？因为左侧蛮多信号拖尾的。

设门了，可能圈的范围比较大。那倪老师Flowing软件作图那个没有颜色怎么回事呀？还有从叠图上可以分析出重合与未重合部门的比例关系么？

作者: Hanty 时间: 2021-12-15 15:11
你好，请问一下我下载的.net framework 3.5软件，安装的时候没有一点反应，是怎么回事，谢谢

作者: Hanty 时间: 2021-12-15 15:12
请问，这个Flowing软件可以打开LMD格式的文件吗，谢谢

作者: niwanmao 时间: 2021-12-15 15:54

Hanty 发表于 2021-12-15 15:12
请问，这个Flowing软件可以打开LMD格式的文件吗，谢谢

可以的。

作者: Phoebe 时间: 2022-4-17 17:56
倪老师，这个软件可以进行降维分析么

作者: niwanmao 时间: 2022-4-17 19:53

Phoebe 发表于 2022-4-17 17:56
倪老师，这个软件可以进行降维分析么

不能的，这个软件当初出来的时候，还没降维这个概念。

降维并非是无所不能的，受到数据量的限制。

作者: Phoebe 时间: 2022-4-18 15:53

niwanmao 发表于 2022-4-17 19:53
不能的，这个软件当初出来的时候，还没降维这个概念。

降维并非是无所不能的，受到数据量的限制。 ...

谢谢倪老师，记得你写过一些降维分析的代码，很厉害。

作者: lxk47640 时间: 2024-3-10 04:57

wilsay@126.com 发表于 2018-7-24 15:13
倪老师，我用flowing怎么打不开FCS文件呢？每次点击时总提示说文件格式不是FCS，可我存的确实是 ...

原因应该是FCS 3.0, 2.0版本的问题，是不是3.0的读不了

作者: niwanmao 时间: 2024-3-10 14:40

lxk47640 发表于 2024-3-10 04:57
原因应该是FCS 3.0, 2.0版本的问题，是不是3.0的读不了

3.0可以读取的

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