请教小鼠 FOXP3的问题

zark_00

我用的ebioscience 的F/P 和Permeabilization 液，过夜固定破膜后，用Permeabilization 液洗两遍，小鼠IgG封闭，后直接加foxp3抗体，本来是常温2小时的，结果有事耽误了，孵育了4小时，请问有没有影响，我用fitc CD4和PE FOXP3标记，怎么只有CD4阳性群，没有双阳群呢，一个同事用同样方法做出来过，只是孵育时间是2小时，没我拖得时间长。我用的是荷瘤鼠的脾细胞悬液。。。

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还有，我脾细胞悬液制备时，用的是1640+10%fbs的培养基，做的研磨，过滤，离心洗涤。到要染表面时，才换的staining buffer 重悬，请问会不会跟悬液制备时有关系

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还有个可能，会不会我抗体加少了，ebioscience的PE FOXP3 ，推荐时1ug ，5ul， 我用的0.2ug

zark_00

niwanmao 发表于 2015-1-13 08:55
1、过夜固定破膜？究竟是固定过夜还是破膜过夜？
2、foxP3孵育，时间太长可能不是很好，抗体荧光容易衰减， ...

谢谢倪老师的回复。

1  我用的eBIOSCIENCE 的 Fixation/Permeabilization液 固定破膜4度过液
2 我就室温孵育了4个小时，做出来的同事是2小时。
3抗体确实没滴定，实验就没摸索过，大量做样本得太急。
4荷瘤鼠和正常鼠可能在T细胞这块有有区别。同事用的正常鼠

倪老师能不能提供个亲自使用过的protocol呢