关于单核细胞negative selection of monocytes from PBMC by MACS的问题

xlswy1984

大家好，我最近在用美天旎 的 磁珠分选（Monocyte Isolation Kit II- negative selection），从外周血的PBMC中提取单核细胞，遇到一些问题。
我从 20 mio. frozen PBMC 中，利用磁珠分选，得到了2-3.5mio. 单核细胞
之后用流式上机检测了一下，如下图：

                               
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问题：
1. 理论上PBMC中有10-20%的单核细胞，有人说 MACS分选单核细胞的 出产率非常不稳定，而我的产率也不高。我想请教有经验的人，你们的单核细胞出产率在多少。分选过程中有什么注意事项么？
2. MACS的分选 单核细胞纯度应该在90%以上。 我的FACS检测去除死细胞，好像纯度也够了，但图中的Q3会是什么细胞呢？
3. 我想请教一下，如果用FACS检测，用PI染色圈出活细胞，PI是最后要上机前再加么？我的细胞是要PFA固定的，会有影响么？
4. 我也不知道为什么会有这么多的死细胞或细胞碎片，是因为是复苏的PBMC么，不过这些PBMC 都是近期用密度梯度离心法提取的，冻存的时间不久。 有什么方法可以改进么？

xlswy1984

niwanmao 发表于 2013-10-29 20:09

                               
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第1个问题是关于MACS分选的，需要@gcz5340 @olivezhou0716  等高手来看看。
第2个问题：Q3可能是残留的淋巴 ...

谢谢您的回答。
关于PI，我还是有些疑问。 我是CD14, CD16抗体染色后，然后固定后，再上机的。那如果我多加一个PI，是不是应该在CD14. CD16 抗体染色后，固定之前呢。
我不太清楚PI 的染色是不是和其他抗体的染色一样的操作。
在调参数的时候，是不是 应设立 unstained， CD14single，CD 16single，PI single， sample， 5个管子啊
感觉细胞固定了以后好像得到的结果比较稳定些。

xlswy1984

niwanmao 发表于 2013-10-29 22:55

                               
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PI的染色，是应该在表面染色之后的，PI粉剂用PBS配成1ug/ml的PI工作液。
你在完成最后一步离心，去除上清 ...

我们实验室 有 PI 是 Biolegend公司买的那种，推荐的是10ul per 1mio. cells
那是不是就应该像一般抗体那样最后加个2ul。
对了，请问为什么不能有PE 呀？