FITC的荧光光谱如图。其除了发出很强的绿色荧光之外,还有一部分强度稍弱的黄色荧光可以被其他通道比如PE通道检测到。因此会使PE通道的检测结果偏大,为了避免出现这种情况,需要人为减去PE通道的一部分荧光信号以得到正确的检测结果,这个过程叫做补偿调节。
在调节补偿的时候,需要单独用实验中涉及的所有荧光染料对细胞分别进行染色。举个例子:我需要看小鼠脾脏中CD4T细胞和CD8T细胞的比例,这个实验需要用到CD3抗体、CD4抗体、CD8抗体,它们的配色如下:CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PerCP。我在做实验的时候,除了染这三个抗体的实验组之外,还需要另外三管:单独染CD3-FITC的单阳管、单独染CD4-PE的单阳管和单独染CD8-PerCP的单阳管。上样的时候,需要先上其中一管单阳管,调节补偿。假如我先检测CD3-FITC单阳管,这个时候,“理论上,FITC应该只在530/40检测器(FITC通道)上产生信号,不应该在580/30检测器(PE)上产生信号。现在要做的是在580/30检测器中减去一定比例的FITC信号,直到fitc染色的细胞在580/30检测器的中值与对照1在同一检测器的中值相等。” |