组织酶消化

heybibna

我做的是肝脏组织用II型胶原酶消化30min后制成单细胞悬液，用碧云天的盒子PI总是染不上色，大约80%细胞没染上色，问了一下技术说是细胞通透性不好，70%乙醇固定了14个小时，还是染不上色，但是用同样的方法做肌肉组织就能染上色，想请教一下，有什么方法可以增加细胞通透性，染上PI？

heybibna

niwanmao 发表于 2021-8-6 07:34
你是要做细胞周期？

做细胞周期，你这里的方法应该是有问题的，首先碧云天盒子的PI究竟是不是AV/PI里面的P ...

是的老师，我是做细胞周期，碧云天盒子说明书上PI染色液的浓度是20x，但是我用这个盒子做肌肉组织的结果能做出来，因为消化下来细胞状态不是很好，用70的乙醇固定完就会有白色絮状物，所以没用乙醇固定就染色了，结果是下面这样的，就是很奇怪G2期比例是0，不明白是什么原因。还有一个问题，就是消化的时候用了0.25%（含EDTA）的胰酶，这会对结果有一定的影响吗？

heybibna

niwanmao 发表于 2021-8-6 13:01
你这个结果也是有问题的，并不是做出来了。
请参考前面给你的protocol做吧。 ...

老师，想问您一下结果具体哪里有问题，因为我现在把所有样本都做了，结果都是类似这样的，有没有可能通过圈门改改善一下结果，或者哪里有问题我能改进一下。

heybibna

niwanmao 发表于 2021-8-7 10:15
原因如下：
1、PE-H/PE-A的粘连体门，你可以去看一下其它地方的图形，从来没有这样画的，也没有这样的分 ...

好的，老师，粘连体那个门是贝克曼仪器工程师教我们这样圈的，我也感觉稍微有点问题，她说把粘连体后面那点散的细胞圈上就会有S期，现在看来结果是不对的，老师我上传一下fcs文件，您能帮忙圈一下吗？

heybibna

niwanmao 发表于 2021-8-7 11:13
你看，有没有发现问题所在？

老师，我按着您这个圈门试了一下，其实我那个G0G1后面那个小峰是粘连体，它后面根本没有S和G2期，所以您判断我染色方法有问题，是这样的吧？

heybibna

老师，还要麻烦您看一下，我按照之前您给的方法重新做了一下，肝脏还是染不上色，肌肉还是只有一个峰，您帮忙看一下是因为什么呢？

heybibna

niwanmao 发表于 2021-8-8 07:48
两种可能性：
1、标本确实没有G2和S期，你做的细胞本身就是静止期的细胞。
2、染色问题。

老师，还要麻烦您看一下，我按照之前您给的方法重新做了一下，肝脏还是染不上色，肌肉还是只有一个峰，您帮忙看一下是因为什么呢？

heybibna

niwanmao 发表于 2021-8-18 21:43
有G2/M峰的，只是比例比较少而已，参考下图这样：

老师，肝脏组织还是染不上色，这样该怎么解决呢，用tritonx-100单独进行透膜处理也还染不上色？

heybibna

niwanmao 发表于 2021-8-19 14:51
肝脏也有，只是非常少，你用modfit都能拟合出来。

老师，我用modfit拟合不出来G2期，我没用自动拟合

heybibna

niwanmao 发表于 2021-8-19 21:49
仔细对照我上面的设门，尤其是R2。然后峰的拟合，请用sync wizard将G2/M期的位置定下来。 ...

老师，想请教一下为什么用sync wizard将G2/M期位置定下来，您是怎么判断这次的峰是G2峰，而第一次那个是没有S期不能跨到G2期的？