肿瘤微环境（TME）是肿瘤细胞与免疫细胞、基质细胞等相互作用的复杂网络，直接影响肿瘤进展和治疗响应。

下面是小鼠样本制备的一些具体步骤，供有需求的FLOWER参考

样本制备（实体瘤组织块）
1. 解剖肿瘤/转移灶。  
2. 将2 mL RPMI培养基（不含FBS）置于冰上备用。  
3. 用手术刀将肿瘤组织切割成2–4 mm的小块，置于洁净培养皿中。  
4. 将肿瘤碎块与液体转移至15 mL Falcon管中。  
5. 用1 mL RPMI冲洗培养皿，并将冲洗液加入含肿瘤碎块的15 mL Falcon管。  
6. 加入1 mL酶解缓冲液（配方：1 mL RPMI + 8 μL Liberase TL（2.5 mg/mL原液）+ 8 μL DNase I（1 mg/mL原液））。  
7. 涡旋混匀。  
8. 37°C水浴震荡孵育30分钟，每隔5分钟手动摇匀（注：此步骤可替换为自动组织解离仪及配套试剂盒，但需避免使用上述酶解缓冲液）。  
9. 冰上终止反应。  
10. 加入2 mL含10% FBS的PBS溶液。  
11. 通过70 μm尼龙细胞筛过滤至50 mL锥形管。  
12. 用5 mL注射器活塞将未消化的组织压过筛网。  
13. 用7 mL含10% FBS的PBS冲洗筛网，最终体积为13–14 mL。  
14. 4°C离心（300 g，5分钟），弃上清。  
15. 用7 mL含2.5% FBS的PBS重悬细胞沉淀。  
16. 在15 mL Falcon管中加入5 mL Histopaque-1119（如需分离单个核细胞与粒细胞，可替换为Polymorphprep）。  
17. 将细胞悬液缓慢叠加于Histopaque-1119液面上。  
18. 不连续梯度离心：室温500 g离心20分钟（关闭离心机刹车）。  
19. 收集中间层细胞，转移至新15 mL管。  
20. 加入8 mL染色缓冲液。  
21. 4°C离心（300 g，5分钟），弃上清。  
22. 重复洗涤步骤：加入5 mL染色缓冲液，离心后弃上清。  
23. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞。  


样本制备（脾脏/淋巴组织）  
若需检测磷酸化蛋白，不建议酶解消化。

淋巴组织（如脾脏、淋巴结）可通过机械研磨制备单细胞悬液：  
1. 解剖脾脏，用橡胶研磨棒在1.5 mL管中与PBS研磨。  
2. 通过70 μm滤网过滤，并用PBS冲洗滤网。  
3. 若悬液中含红细胞，需进行红细胞裂解（红细胞易非特异性结合抗体，增加背景）。  
4. 细胞计数。  


表面抗原染色方法  
获得单细胞悬液后，按以下步骤进行多参数表面抗原染色：  
1. 将2–10×10⁶个细胞/样本（根据目标细胞比例调整）重悬于25 μL PBS，加入96孔V型底板（注：大样本推荐使用96孔板以减少洗涤损失）。  
2. 每孔加入100 μL预滴定活/死细胞染料（如Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell Stain）。  
3. 室温避光孵育15分钟。  
4. 每孔加入100 μL染色缓冲液，4°C离心（300 g，5分钟），弃上清（注：需优化离心速度以减少样本损失）。  
5. 每孔加入25 μL Fc阻断混合液（配方：2 μL抗小鼠CD16/CD32抗体 + 23 μL染色缓冲液）。  
6. 冰上避光孵育30分钟，离心后弃上清。  
7. 加入100 μL预滴定抗体混合液（注：所有抗体浓度需根据细胞类型和数量优化）。  
8. 冰上避光孵育30分钟。  
9. 加入100 μL染色缓冲液洗涤，离心后弃上清。  
10. 若仅标记表面抗原，加入100 μL染色缓冲液后转移至含200 μL缓冲液的5 mL管，即可上机分析。若需标记二抗或链霉亲和素，重复步骤7–9。  


胞内抗原染色方法  
1. 完成表面抗原染色后，再进行细胞内抗原标记。  
2. 每孔加入100 μL固定/破膜缓冲液，涡旋混匀。  
3. 4°C避光孵育30分钟。  
4. 加入100 μL破膜缓冲液，离心（300 g，5分钟），弃上清。  
5. 用100 μL破膜缓冲液重悬细胞。  
6. 加入200 μL正常小鼠/大鼠血清（阻断非特异性结合）。  
7. 室温孵育15分钟，离心后弃上清。  
8. 加入100 μL预滴定内部抗体（溶于破膜缓冲液），室温避光孵育30分钟。  
9. 用100 μL破膜缓冲液洗涤两次，离心弃上清。  
10. 若仅标记一抗，加入200 μL染色缓冲液后即可上机分析。若需标记二抗或链霉亲和素，重复步骤8–9。  


注意事项  
1. 固定/破膜缓冲液：优先使用抗体供应商推荐的缓冲液；若无，需自行优化。  
2. 酶解影响：部分酶（如dispase）可能降解表面标记，需预先验证消化条件。  
3. 细胞数量：淋巴组织（如脾脏）中目标细胞比例高，所需细胞量较少；实体瘤中免疫细胞比例低，需增加细胞量。  

最后附上一张分析示例，分析CD4+T细胞的不同转录因子水平：



信源：Santinon, F., Young, Y.K., del Rincón, S.V., Mann, K.K. (2023). Analyzing the Tumor-Immune Microenvironment by Flow Cytometry. In: Ursini-Siegel, J. (eds) The Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology, vol 2614. Humana, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2914-7_2