微塑料，这个听起来熟悉又陌生的环境污染物，早已无处不在。从深海到高山，从饮用水到餐桌，这些直径小于5毫米的塑料碎片正引发全球担忧。

然而，我们对其真实数量的了解，可能还存在一个巨大的盲区。尤其是那些尺寸小于10微米、甚至仅几微米的“更小微塑料”，它们更容易进入生物体循环，潜在风险更大，却因检测技术所限，长期“隐身”于环境样本中。

传统方法的困境：看得慢，还看不准

传统的微塑料检测，通常依赖于显微镜观察或红外/拉曼光谱分析。这些方法虽成熟，但存在两大痛点：

• 难以有效检测和计数小于几微米的颗粒。
• 需要在滤膜上逐个计数，过程繁琐，难以应对大量环境样本的分析需求。
  

流式细胞术，作为一种能够快速分析液体中悬浮颗粒大小和浓度的技术，本应是解决上述痛点的理想工具，像一道高效的“检测流水线”，颗粒逐个通过激光束，通过分析其散射光和荧光信号，就能在几分钟内完成计数和鉴定。

但要利用流式细胞术精准捕获微塑料，一个关键步骤是给它们贴上明亮的“荧光标签”。目前最常用的荧光染料是尼罗红，它能选择性地结合在塑料表面，使其在激光照射下发出荧光。

但问题来了：传统的尼罗红染色方法，染料只是“粘附”在微塑料表面。染色效果极易受塑料聚合物类型和表面特性的影响，导致荧光强度弱而不稳，很多微塑料因此无法被灵敏检测，造成漏检。

来自日本研究团队的一项最新研究，成功开发了一种名为 “溶胀介导尼罗红染色” 的新方法，彻底改变了染色逻辑。

该方法的核心在于利用一个“溶胀-收缩”的巧妙过程：

• 溶胀：在微塑料水样中加入少量良溶剂（如四氢呋喃，THF），微塑料会像海绵吸水一样膨胀变大。
• 染色：此时加入尼罗红染料，染料分子便能轻松扩散、渗透到微塑料的内部聚合物基质中。
• 收缩封装：通过室温蒸发去除有机溶剂，微塑料收缩回原始尺寸，成功将染料分子牢牢封装在其内部。
  

原文图1：溶胀介导尼罗红染色流程示意图

首先将微塑料悬浮液与表面活性剂Tween-20混合，然后加入THF使颗粒溶胀，接着加入尼罗红溶液染色，最后通过室温蒸发去除THF，使颗粒收缩并封装染料，最后稀释以备检测。

这种方法带来的好处：

• 荧光更强更稳：染料被封装在内部，不易泄漏，荧光信号强度远超传统表面吸附法。
• 染色更均一：不受表面特性影响，对不同类型微塑料的兼容性更好。
• 适合小颗粒：即使是直径小至2微米的微塑料，也能被有效染色和检测。
  

原文图6：染色效果对比（溶胀法 vs 传统法）

（a）明场图像显示多个微塑料颗粒。（b）同一视野的荧光图像，清晰显示经过溶胀法染色的颗粒发出极其明亮的荧光，而未经溶胀处理的颗粒荧光信号非常微弱。

为了达到最佳检测效果，研究人员对染色条件进行了精细的优化：

1、THF浓度

THF是引发溶胀的关键。浓度太低（<15%），颗粒溶胀不充分，染料进不去，染色效率暴跌至0.1以下。浓度太高（>30%），颗粒可能被过度溶胀甚至部分溶解，导致计数效率下降。最终确定25%的THF浓度为最佳点，此时染色效率和计数效率均接近100%。

2、尼罗红浓度

染料浓度也非越高越好。研究发现，当尼罗红浓度在1-50 µg/mL时，染色和计数效率都稳定在接近1的理想水平。浓度低于5 µg/mL，每个颗粒包裹的染料量不足，荧光强度不够；浓度高于20 µg/mL，染料分子在水中易形成不发光的“H-聚集物”，这些聚集体会被流式细胞仪误计为颗粒，干扰真实计数，同时也导致颗粒内部荧光强度下降。最终选择10 µg/mL作为最佳浓度，以实现单个颗粒的最大荧光强度。

3、表面活性剂Tween-20浓度

表面活性剂能防止染料在水中聚集。实验表明，Tween-20浓度在0.05%至1% 范围内，能有效维持高的染色和计数效率。浓度过低时，染料发生聚集，同样会造成计数干扰。最终选择0.1% 的折中浓度，在保证效果的同时避免产生过多泡沫。



在确定了最优方法后，研究团队对其性能进行了全面评估。

1、染色效率近乎完美
使用2微米、5微米和10微米的聚苯乙烯微球进行测试，所有尺寸颗粒的染色效率均接近1.0（100%）（见下表）。这意味着，几乎所有经过此方法处理的微塑料都被成功标记上了明亮的荧光。

表：2、5和10微米聚苯乙烯颗粒悬浮液的流式细胞术测量结果总结

PS颗粒悬浮液	染色效率	回收率	计数效率
2 µm	0.996 ± 0.005	0.968 ± 0.028	0.972 ± 0.026
5 µm	0.976 ± 0.003	0.906 ± 0.022	0.928 ± 0.024
10 µm	0.997 ± 0.003	0.799 ± 0.126	0.801 ± 0.127

注：不确定度为扩展不确定度（k=2，置信水平约95%）

2、准确计数有诀窍：理解“计数效率”

细心的读者可能发现，表2中的“回收率”并非100%，尤其是10微米的大颗粒，回收率较低。这是否意味着方法有问题？

研究指出，这主要是流式细胞仪本身的“计数效率” 所致，而非染色过程。大颗粒在流式细胞仪的进样管和流动室中更容易因沉降或吸附在管壁而损失，导致仪器检测到的数量低于实际添加的数量。

关键在于，只要通过标准颗粒预先测定流式细胞仪对不同大小颗粒的计数效率，就可以在测量真实样品时进行校正，从而获得准确的微塑料绝对数量。

3、抗干扰能力强，适用于真实环境

为了模拟真实水环境的复杂性，研究人员在含有高岭土颗粒（模拟无机杂质）和自来水（含溶解性物质和细小颗粒） 的模拟环境样本中进行了加标回收实验。

结果相当不错：对于2微米和5微米的微塑料，在经过计数效率校正后，回收率分别达到0.993 ± 0.038和0.988 ± 0.029，与在超纯水中的结果无显著差异。这表明，该方法在面对复杂环境基质时，依然能保持出色的定量能力。

将这种高效的溶胀介导染色法与流式细胞术相结合，犹如为环境科学家提供了一台强大的“微塑料普查仪”。

1. 
   
2. 参考文献：Kuruma Y, Sakurai H, Okuda T. Highly efficient Nile red staining for the rapid quantification of microplastic number concentrations using flow cytometry. Anal Methods. Published online November 13, 2025. doi:10.1039/d5ay01093d
   

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