大鼠脾细胞Treg的同型对照及Th17的刺激剂问题

以梦为x马

问题1：比如用PMA和离子霉素刺激CD4+T细胞，通过抗IL-17染色来检测TH17细胞，这个PMA是促使 本来TH17细胞分泌更多的IL-17还是促使CD4+T细胞分化更多的TH17？
问题2：我做大鼠Th17和Treg
            Th17样本组：CD4-FITC,   IL-17A-PE；      对照组：CD4-FITC,  PE同型对照
            Treg样本组：CD4-FITC,  CD25-APC, Foxp3-PE；   对照组1：CD4-FITC,  APC同型对照，Foxp3没加；对照组2：CD4-FITC,  CD25没加，Foxp3-PE同型对照            
对照组哪种比较好？

问题3：做人的Th17细胞，我用PMA和离子霉素刺激，BFA阻断，CD4-FITC和IL-17A-PE设门行不行，“之前有报道PMA刺激导致CD4内吞，导致CD4阳性细胞无法检测”。如果我用CD4-PerCP和IL-17A-PE设门可以检测，这种结果可以令人信服吗？

以梦为x马

treg的一张图，未用对照（对照效果不好）

niwanmao

1、PMA等主要起到活化和刺激作用，促进分泌IL-17

2、Th17对照可以这么设，Treg组的对照应该是：①CD4、CD25、PE同型（或不加PE同型也可）②CD4、FoxP3、APC同型（或不加也可）。

3、换了种荧光能够做出来当然是可以的，为什么不行呢？

niwanmao

以梦为x马 发表于 2015-1-25 14:07
treg的一张图，未用对照（对照效果不好）

可以如下图设门圈中Treg细胞。

以梦为x马

老师，我是流式的新人，看了关于流式的基本知识和基础篇的全部帖子，流式只算是刚刚入门，附件是我第一次做的大鼠TH1，TH17，TREG,老师您能帮我分析分析吗？先谢谢啦{:soso_e100:}TH1、TH17：PMA+离子霉素刺激和BPA阻断，CD4-FITC,CD17-PE
treg：CD4-FITC，CD25-APC,FOXP3-PE
treg对照：CD4-FITC，CD25-APC,FOXP3同型对照

以梦为x马

老师，谢谢您的回复。
1.您的意思就是PMA只是诱导TH17促进-IL-17的分泌，并不能诱导CD4+T分化为TH17？
2.treg对照我只想设置一管，最优化的如何标记呢？因为这次CD25感觉没有分好
3.做人的TH17时，CD4-FITC标记时根本分不开来，后来改为CD-PERCP,可以看到，但是老师您之前的帖子讨论过国内如用PMA刺激，CD4设门的结果都是有待争议的？如果PMA导致CD4内吞，那么也就是有一定比例的CD4是不管用什么标记都是标不出来的，但为何改为percp还是可以标出来呢，难道仅仅是因为percp荧光强度比FITC强？

niwanmao

以梦为x马 发表于 2015-1-25 21:28
老师，谢谢您的回复。
1.您的意思就是PMA只是诱导TH17促进-IL-17的分泌，并不能诱导CD4+T分化为TH17？
2.tr ...

1、我的理解是这样，PMA是一种激动剂，可以使Th17的功能充分发挥出来，从而被检测到，如果不活化，Th17不发挥其应有的功能，IL-17你几乎就检测不到。所以，我认为不是诱导分化，而是诱导分泌。

2、严格设置的话，还是应该设置两管，但如果真的有经验，你象上面你传的这个图，其实分群已经很明显，不加对照都没问题。设一管的话跟不设对照没什么区别。

3、我觉得可能跟你的克隆有关，你看看说明书上或试剂管子上的克隆号看。

以梦为x马

老师，您能帮我数据稍微分析一下吗，希望有个前辈稍微讲解一下，下次我自己分析就能更加有自信。

niwanmao

以梦为x马 发表于 2015-1-26 12:41
老师，您能帮我数据稍微分析一下吗，希望有个前辈稍微讲解一下，下次我自己分析就能更加有自信。 ...

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以梦为x马

可是我现在就2个数据，如果下次我开始批量做我再购买可以吗？