关于GFP荧光自发降解问题

xhxiejing

各位老师，这里想向大家请教一个问题。我也是流式新手，现在做流式遇到一个问题。我用的是LC3-GFP稳转细胞系，目的是检测药物对LC3量的影响，通过GFP荧光强度的改变来反映。我的细胞都是胰酶消化下来后直接上机FL1通道检测。在测得过程中发现，即使在避光，冰上放置的操作条件下，GFP的荧光降解仍然比较明显。想请教有什么办法能够阻止GFP的降解呢，是否固定下细胞会好些呢？谢谢各位高手了！

niwanmao

我想起来曾经有这么一个帖子－检测GFP转染细胞的周期：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=1331
里面提到乙醇固定之后，GFP容易漏出，你的标本虽然没有经过乙醇固定，但可能由于胰酶消化等因素，导致细胞膜受损，GFP漏出，而不是降解的原因吧。

所以，我觉得可以试试上述帖子中提到的，用1％多聚甲醛固定试试。

@huzengwu @stef1981 @gcz5340 @liyouzzz_000 @luqhcolalove @zhouyongbao 等高手有没有什么其它更好的建议？

luqhcolalove

这个降解没办法避免的，与荧光强度有关的GFP检测，我们一般通过设相关对照，用实验组对应对照组来看药物是否有影响，实际操作中没法避免。还要注意有些GFP不是单一FL1能测到的，我们碰到过FL2,FL3,以及APC通道都能测到，就是平常说的荧光污染。实验过程中造成的荧光降解属于实验系统性误差，只能通过设相应对照来排除。

xhxiejing

niwanmao 发表于 2012-9-11 11:46

                               
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我想起来曾经有这么一个帖子－检测GFP转染细胞的周期：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthre ...

好的，谢谢倪老师，这个论坛真是太好啦，我try一下去

xhxiejing

luqhcolalove 发表于 2012-9-11 12:10

                               
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这个降解没办法避免的，与荧光强度有关的GFP检测，我们一般通过设相关对照，用实验组对应对照组来看药物是 ...

是的，我也发现很难避免自发降解，所以我只能每次上机一次性测不多于十二个样，而且冰上，避光操作，即使这样，最后一个样和第一个样（为相同的用于判断GFP是否降解的对照）相比仍有一定程度的降解。谢谢您的指点啦！

xhxiejing

niwanmao 发表于 2012-9-11 11:46

                               
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我想起来曾经有这么一个帖子－检测GFP转染细胞的周期：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthre ...

刚对比了下固定与不固定的差别，发现固定这一步本身会减弱GFP的荧光强度，但与不固定相比，固定了之后的细胞，GFP的荧光下降要稍慢一些

gcz5340

这到底是个什么实验啊，GFP是很稳定的荧光蛋白，检测的时候怎么可能会降解呢。我做过很多的GFP sorting，分选之后荧光一点都没有下调，检测更没有影响了。
建议楼主把你实验的目的、流程和现象再说详细点。一般标记荧光素抗体的时候不立即检测会固定一下，这也是防止抗原抗体复合物解离，应该也没有什么抗猝灭的作用，更何况你活细胞根本就不需要固定啊。

niwanmao

gcz5340 发表于 2012-9-11 21:17

                               
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这到底是个什么实验啊，GFP是很稳定的荧光蛋白，检测的时候怎么可能会降解呢。我做过很多的GFP sorting，分 ...

就象我在上面说的那样，我在猜测@xhxiejing 的细胞会不会可能由于胰酶消化，导致gfp漏出，从而误认为降解？

xhxiejing

gcz5340 发表于 2012-9-11 21:17

                               
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这到底是个什么实验啊，GFP是很稳定的荧光蛋白，检测的时候怎么可能会降解呢。我做过很多的GFP sorting，分 ...

您好，我详细描述一下我的实验目的和步骤吧，麻烦您也替我分析一下。
我是用CHO细胞稳转了欧联了GFP的目的蛋白，建立一个筛药的系统，看各个新化合物对我的目的蛋白的影响，是上调还是下调。如果药物对可促进我的目的蛋白的降解，那么相应的GFP的荧光强度也会下降。我操作时都是用十二孔板，胰酶消化后直接PBS重悬细胞上机测试。我第一个样和最后一个样总是设成一样的，平行对照，来看我整个操作过程有无荧光的自发降解，然后就发现，最后一个样品总是比第一个样品荧光值要低。这就比较干扰我的实验，因为我不能确定某个药物作用下GFP荧光的下降，是由于药物本身对我的目的蛋白有下调还是由于GFP荧光强度的自发下降。

gcz5340

你说的荧光强度下降是指mean值吗，百分比有变化吗，重复几次都这样吗，能否上图看一下？一般来说GFP是很稳定的，流式激光照射甚至共聚焦拍照它都很难淬灭，你这前后几管而且冰上避光肯定不会有影响的。

另外对于你这个系统我有点疑问，你说的稳转株应该是转染了目的基因和GFP基因的质粒，然后表达目的蛋白和GFP蛋白，你的药物促进目的蛋白降解，那么你的GFP是不是有可能不降解啊，当然这个和你的问题不相干，外行的话楼主请一笑而过啊。