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如何分析小鼠大脑中的免疫细胞和胶质瘤细胞?来看示例吧

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发表于 2023-6-26 21:31:18 | 显示全部楼层 |阅读模式

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弥漫性胶质瘤是原发性脑癌中最常见的一种,占所有癌症的<2%,但死亡率高。神经胶质瘤被认为起源于发生表观遗传学和遗传学变化的神经元和胶质祖细胞群,随着额外基因组变化改变,从而进一步演变为更高级别肿瘤。根据是否存在异柠檬酸脱氢酶 (IDH)IDH1 或 IDH2 突变,最新 WHO 2021 更新的中枢神经系统肿瘤分类将胶质瘤分为两个主要组。IDH 突变的胶质瘤通常表现为低级别胶质瘤(弥漫性星形细胞瘤或少突胶质细胞瘤),中位生存期 > 10年。相比之下,IDH野生型胶质瘤是一组预后不良的肿瘤,中位生存期为12-15个月,包括胶质母细胞瘤,在成人胶质瘤中占大多数。

尽管在理解驱动胶质瘤的分子途径方面取得了重大进展,但尚未转化为新的有效疗法,其中一个关键挑战是胶质瘤细胞可弥漫性浸润到正常大脑中,因此,尽管采用综合治疗方法,但几乎总是复发。最近的研究集中在胶质瘤细胞如何与神经元相互作用,这可以影响肿瘤增殖和对治疗的反应。因此,需要改进研究胶质瘤中肿瘤形成以及胶质瘤细胞如何与微环境相互作用的分析方法。

原位胶质瘤的小鼠模型是研究肿瘤发生和发展的必要工具,在免疫活性环境中发生的肿瘤使得我们可密切监测免疫细胞的浸润。目前有两个关键的小鼠模型,即使用胶质特异性启动子(即GFAP-Cre)的基因工程小鼠模型 (GEMM)和同系鼠细胞系的立体定向颅内移植(即CT-2A)。在胶质母细胞瘤的 GEMM模型中,可发现肿瘤发生时的分子特征。CT-2A 细胞系失去谱系标记物 (O4、ASCA2),可诱导T细胞浸润大脑。

小鼠大脑的免疫微环境主要由小胶质细胞 (CD45+ CD11b+ CX3CR1+) 组成,胶质瘤被认为是显著的免疫抑制环境,表现出较差的 T 细胞浸润和对免疫治疗的反应。肿瘤的流式细胞术监测是评估脑内发生的肿瘤的细胞起源和免疫浸润的一种快速的定量方法。(脑组织消化小帖士:用将2.5 mL木瓜蛋白酶和125 μL DNase,在50 mL 试管中消化小鼠脑组织,37℃下以 110 rpm 孵育30 min。在孵育中途用玻璃管研磨,直至溶液呈乳白色。

下图是小鼠大脑内主要细胞类型的流式细胞术设门步骤。(a) 在非荷瘤脑中分出免疫细胞 (CD45 +)、脉管细胞 (CD49a +)、少突胶质细胞 (O4 +)、星形胶质细胞 (ASCA2 +) 和双阴性 (O4-ASCA2-,通过PCR确定是NeuN+的神经元) 群体的设门方案。 (b) 图是分析 CT-2A小鼠模型荷瘤大脑的少突胶质细胞、星形细胞和肿瘤细胞的设门步骤。 (c) 图是非荷瘤大脑O4+ 细胞群少突胶质细胞谱系分析(CD133、CD140a散点图分出4个群体)
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进一步对CD45+免疫细胞分群。(a) 在非荷瘤脑中分出小胶质细胞 (CD11b+ CX3CR1+)、T细胞 (CD3+) 和 B细胞 (CD19+) 。(b)CT-2A荷瘤脑分析,明显可见T细胞浸润增加,小胶质细胞的CX3CR1表达量减少。
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信源:Moffet JJD, Moore Z, Oliver SJ, et al. Flow Cytometry Identification of Cell Compartments in the Murine Brain. Methods Mol Biol. 2023;2691:185-198. doi:10.1007/978-1-0716-3331-1_14
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