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[淋巴细胞相关] 关于CD4标记

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发表于 2024-1-29 21:49:31 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
老师您好。

我最近的实验 实验九抗原刺激过够的CD4 T 细胞相关表型及功能。 但流式结果很诡异:CD4用APCcy7标记。 经常出现CD4完全标不出来的情况。但他又不是每一个都标不出来 有的又能标出来。我知道PMA刺激的话可能引起CD4内吞,不过我并不是PMA抗原,并且甚至我的空白孔,无抗原刺激的孔也标不出来。     而且更诡异的是,还出现了同一份标本不同的孔,有的标出来有的标不出来的问题(除1微升加入的试剂不同外其余条件相同)。

我自己也尝试去找原因,对于没标出来的样本重新再加一次,依旧标不出来。而且这种情况出现了很多次,基本排除操作失误没有加上抗体的情况。而且CD4标不出来的标本,CD45RA也标不出来。
我的实验是会破膜的,这个破膜对CD4和CD45RA的标记有影响呢? 但还是那个情况,并不是所有人都标记失败,也有成功的,甚至同一个人的样本也有成功失败的。所以现在十分迷茫究竟是哪一步出了问题 老师能麻烦帮我分析下原因吗?

失败

失败

成功

成功
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 楼主| 发表于 2024-1-29 21:56:41 | 显示全部楼层
补充:虽然分的不是很开 单后续的分析是完全没问题的 该圈的门都能圈上,但如果CD4没有任何表达 那后续就没法儿看了
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发表于 2024-1-30 13:34:32 | 显示全部楼层
你还是把操作步骤说一下吧,让大家看看你基本排除操作的对不对
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 楼主| 发表于 2024-1-31 00:29:06 | 显示全部楼层
步骤简单来讲,第一步,差速离心法提取外周血PBMC,而后将PMBC种在96孔板,体系200ul,包含培养基和相关抗原,在培养初始便加入了趋化因子相关的流式抗体(过夜后标不出来)以及BFA,刺激16h后拿出来,先直接标记表面蛋白相关流式抗体,再破膜标记胞内细胞因子。最后的结果里,除了CD4和CD45RA,其余的胞内或表面都标记出来了。
现在我怀疑是因为最初有些病人肝素样本太少便混入了一些EDTA和枸橼酸钠抗凝的血,可能是这个原因。正在做不混样本的实验验证,如果明日结果 所有不混样的都能标出来就基本可以确定是抗凝剂的问题。
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 楼主| 发表于 2024-1-31 00:29:30 | 显示全部楼层
Yuck 发表于 2024-1-30 13:34
你还是把操作步骤说一下吧,让大家看看你基本排除操作的对不对

所以步骤上应该没有太大问题
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发表于 2024-1-31 03:20:34 | 显示全部楼层
有没有可能是抗体本身的问题?虽然概率有点低
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发表于 2024-1-31 09:18:08 | 显示全部楼层
zdvfsadb 发表于 2024-1-31 03:20
有没有可能是抗体本身的问题?虽然概率有点低

这个好验证,直接拿原pbmc染一下看看有没有表型就行。你用的相关抗原刺激是不是有CD4,导致染抗体时候表位被占了?
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 楼主| 发表于 2024-1-31 15:16:49 | 显示全部楼层
Yuck 发表于 2024-1-31 09:18
这个好验证,直接拿原pbmc染一下看看有没有表型就行。你用的相关抗原刺激是不是有CD4,导致染抗体时候表 ...

抗体是BD的,我们医院临床项目都是用的这支抗体,应该不会是抗体本身原因。 并且同批样本中也有一部分样本CD4是能标出来的 所以抗体本身应该没问题
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发表于 2024-2-6 10:56:37 | 显示全部楼层
有些刺激剂会诱发细胞表面CD4分子被内吞。你可以试试用CD3和CD8反圈门。
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