高维流式细胞仪数据：是真金矿还是黄铁矿？

niwanmao

注：本文翻译自2024年5月8日Cytometry A杂志上Niewold P.发表的一篇Letter，在内容概括上做了优化，适合大家快速阅读。 标题中提到的『黄铁矿』外型与黄金相类似，因此又称为愚人金(Fool's Gold)，即假黄金。

自从20世纪70年代以来，流式细胞术一直是探索细胞表型的宝贵工具，技术的演进促使激光器和探测器数量激增，从而能评估更多参数。用户常面临无法将所有关注的标志物融入单一实验方案的困境，催生了“越大越好”的普遍心态。因此，光谱流式细胞仪的商业化推出，凭借其整合光谱相近的荧光素、量化细胞自然荧光并高效利用全光谱的能力，受到了热烈欢迎，特别是对于珍贵或有限（如临床）样本的分析。

然而，随着实验方案复杂度的提升，一系列新的挑战也随之而来。尽管方案设计与数据分析的基本原则保持一致，但保证数据质量、界定细胞群体的标准，以及将表型变化解析为生物学意义的工作，愈发艰巨。

1. 方案设计
构建大型光谱方案不是即兴之举，需要经过严谨的测试与优化，需要耗费可观的时间和经济成本。为提高技术普及度和数据质量，已有多篇文章讨论了如何优化方案设计，比如Nguyen等人的工作（Nguyen R, Perfetto S, Mahnke YD, Chattopadhyay P, Roederer M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 2013; 83(3): 306–315.），基于特定仪器的荧光素特性及光谱扩散知识，指导如何将标志物合理分配至荧光通道。此外，诸如溢出扩散矩阵和复杂性指数等工具，也有助于优化荧光素的组合选择。

2. 单染对照
染色方案确定后，通过合适的单染对照，并评估其分辨能力至关重要。Ferrer-Font等人概述了从理论设计到实现多色样本有效解混的全过程（Ferrer-Font L, Pellefigues C, Mayer JU, Small SJ, Jaimes MC, Price KM. Panel design and optimization for high-dimensional immunophenotyping assays using spectral flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 2020; 92(1):e70.），其中关键在于使用单染细胞对照而非微球，因微球结合特定荧光素时会发生光谱偏移，导致多色分析中的解混误差。这对于构建多达40色的全光谱方案尤为关键。

Spiteri等人则展示了在处理自发荧光水平各异的组织源样本时的最佳实践，强调了在不同自发荧光背景下有效解混和获取细胞亚群附加信息的重要性。（Spiteri AG, Pilkington KR, Wishart CL, Macia L, King NJC. High-dimensional methods of single-cell microglial profiling to enhance understanding of neuropathological disease. Curr Protoc. 2024; 4(3):e985.）

3. 样本
大方案在临床队列研究中展现出巨大潜力，因其能从单次和少量样本中提取更多信息。然而，这类研究常需处理的标本数量很多，且在数周乃至数月内分批染色，容易引入批次间变异性。因此，有必要制定标准化操作规程，对确保染色与采集的一致性，提高可重复性至关重要，确保在不同时间点使用新鲜和冷冻全血及PBMC的染色与采集重现性。

4. 数据分析和解读
在解决了技术层面的挑战后，数据分析和解读成为下一步的关键。尽管人工分析在大型方案中仍可行，但其费时且难以识别表达模式新颖的细胞亚群。为此，开发了多种算法辅助数据挖掘，如UMAP和FlowSOM等降维与聚类算法的联合应用，有助于可视化样本内的细胞类型多样性。然而，人工设门仍是必要的，以验证目标细胞群不是解混或分析设置不当的结果。

同时，对于聚类数据的统计分析需谨慎处理，确保区分信号与噪音，多重检验校正或加权分析策略对于确保结果的有效性和可重复性尤为重要。

科学界对高维流式数据挑战的深入认识及其解决方案的积极研发，确实是在挖掘真正的金矿，但同时，我们在追求数据的广度和深度应始终注重增进对生物学机制的深入理解，而非仅仅为了识别罕见细胞群体，避免把真金变成假金。

参考文献：Niewold P. High-dimensional flow cytometry data: goldmine or fool's gold?. Cytometry A. Published online May 8, 2024. doi:10.1002/cyto.a.24849