CD19消失后，如何追踪"隐身"的B-ALL细胞？

niwanmao

B细胞前体急性淋巴细胞白血病（BCP-ALL）是儿童中最常见的癌症类型。在过去的几十年里，得益于精准的治疗策略，儿童BCP-ALL的长期生存率已经突破了90%。这场胜利的关键之一，在于我们能够精确监测治疗后体内残存的极少量白血病细胞。MRD的水平是决定后续治疗方案、预测复发风险的最重要指标。

然而，医学的进步也带来了新的挑战。近年来，以CD19蛋白为靶点的靶向免疫疗法，如双特异性T细胞衔接器（BiTEs）和CAR-T细胞疗法，已成为治疗BCP-ALL的革命性武器。但狡猾的白血病细胞总能找到对策：部分白血病细胞通过“脱掉”细胞表面的CD19这件“外衣”来逃避靶向药物的攻击，导致疾病复发。这类“CD19阴性复发”的比例可高达50%。

这给传统的、依赖CD19作为主要“导航”标记的流式细胞术MRD检测方法带来了巨大难题。当白血病细胞“隐身”后，检测的可靠性大打折扣。在使用传统的8色流式细胞术方法时，不同专家对CD19阴性样本的判读一致性（再现性）从90%显著下降到了81%。显然，我们需要一套更强大的工具来追踪这些会“隐身”的白血病细胞。为此，EuroFlow联盟发起了一项研究，旨在开发一套全新的12色流式细胞术检测“组合”，以应对CD19靶向治疗后的新挑战。

打造更强的“侦测雷达”：寻找新的细胞标记

研究的第一步，是为这套新的检测系统寻找除CD19外、能够稳定识别BCP-ALL细胞的新“雷达信号”。研究团队系统性地评估了EuroFlow标准诊断组合中的多个抗体标记在237例初诊BCP-ALL患者样本中的表达情况。

分析发现，CD22和CD24这两个标记物在大多数BCP-ALL细胞上都有表达，成为了最有潜力的候选者。然而，进一步的分析揭示了单纯依赖这两个标记的局限性：
少数患者（约3%）的白血病细胞同时不表达CD22和CD24。
这两个标记也并非B细胞或BCP-ALL细胞所独有，其他细胞也可能表达，容易造成混淆。

为了构建一个更精准、更可靠的检测系统，研究者们决定采用“组合拳”策略。他们额外引入了两个关键元素：
1.  增援标记 (Reinforcement Marker)：加入了HLA-DR，这是一个早已被证实、广泛表达于B细胞及BCP-ALL细胞的标记物，作为额外的识别维度。
2.  排除标记 (Exclusion Markers)：巧妙地加入了CD3和CD7这两个T细胞和NK细胞的特异性标记。通过这一步，可以在分析时预先“排除”这些正常的淋巴细胞，从而让BCP-ALL细胞的“身影”在背景中更加清晰。

从理论到实践：12色EuroFlow MRD检测组合的诞生

在确定了核心标记物后，团队开始了艰苦的“组合”优化工作。他们以经过长期验证的EuroFlow 8色MRD检测组合为基础骨架，在三个阶段中不断测试和改良，最终确定了两套稳定、高效的12色双管方案。
样本处理：采用EuroFlow标准化的全血裂解法处理骨髓或外周血样本。
抗体孵育：样本细胞与精心设计的12色抗体“鸡尾酒”进行孵育染色。最终定型的两套试管组合如下 ：

• 试管1：包含核心骨架（CD81, CD66c/CD123, CD34, CD19, CD10, CD38, CD20, CD45），并整合了新加入的CD22, CD24, HLA-DR以及排除标记CD3/CD7。
• 试管2：与试管1大部分相同，但将HLA-DR替换为CD73/CD304，用以获取关于细胞状态的更多维度信息。
  

* 上机检测：目标是达到$10^{-5}$（十万分之一）的超高灵敏度，因此要求每个样本至少采集400万个细胞。

实战检验
一个新方法的好坏，必须通过严格的临床验证。研究团队使用这套新的12色组合检测了101例BCP-ALL患者的随访样本，并将其结果与被誉为“金标准”的分子生物学MRD检测结果进行了正面“对决”。

结果见下图，(A) 12色流式细胞术MRD（Flow MRD）与分子生物学MRD（Mol MRD）结果对比。两者在可量化的阳性样本中显示出极佳的相关性（$R^{2}=0.8845$）。黑点代表CD19阳性MRD，红点代表CD19阴性MRD。 (B) Bland-Altman分析显示两种方法之间偏差很小，结果高度一致。

• 高度一致性：新方法的检测结果与分子生物学方法的总体一致性高达86%。
  

精确定量：在两种方法均为阳性的样本中，其MRD水平的定量结果表现出极好的相关性（$R^2=0.8845$）。
攻克难关：更关键的是，在30例双阳性样本中，有5例是棘手的CD19阴性BCP-ALL，新方法同样给出了与分子生物学高度一致的结果，证明了其在靶向治疗后场景中的实用价值。


新方案的真正威力，在于它能“看见”过去几乎无法被识别的、极其微量的残留病灶。

下图展示了一个真实的案例，该患者在接受CD19 CAR-T治疗后发生了CD19阴性复发。图中深蓝色点代表BCP-ALL细胞（仅64个，占总白细胞的0.0006%）。这些细胞不表达CD19，但通过新组合中的其他标记（如CD10+、CD24+、dimCD22+等）被精准地识别出来。如果使用传统的8色方法，这样一小群“隐身”的白血病细胞极有可能被漏检。




尽管在常规病例中，新方法的整体性能与经典的8色方法相当，但它的优势在于：
1.  更易于识别：额外的标记物提升了B细胞群的界定清晰度，尤其是在CD19缺失的复杂情况下，大大降低了人工判读的难度，提高了专家间的一致性。
2.  提供额外信息：该组合包含了对CD22的检测。CD22是另一个重要的白血病治疗靶点，因此，这份检测报告在评估MRD的同时，还能为医生提供关于患者是否适合接受CD22靶向治疗的宝贵信息，真正做到了一举两得。


参考文献：Verbeek MWC, et al. Minimal residual disease assessment following CD19-targeted therapy in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia using standardized 12-color flow cytometry: A EuroFlow study. Hemasphere. 2025 Apr 13;9(4):e70125. doi: 10.1002/hem3.70125. PMID: 40224162; PMCID: PMC11993931.