Q和B不够稳定，学习一下流式细胞仪性能评估的新指标

niwanmao

在日常科研和临床应用中，如何客观、量化地评估一台流式细胞仪的性能，确保其能够稳定、准确地提供数据，一直是困扰操作者的难题。

传统的Q值（检测效率）和B值（背景噪声）评估方法虽然沿用了30多年，但往往不够稳定，甚至可能产生负B值，难以用于不同仪器间的横向比较。

美国国家标准与技术研究院 (NIST) 开发出一种改进的新模型和一系列新的性能指标，旨在提供更稳定、更具可操作性的信息，帮助我们更科学地评估流式细胞仪性能。

1. 告别传统，拥抱新指标——P-指标的诞生

过去，流式细胞仪的性能评估常常受限于校准微球的固有变异性，导致检测限（LOD）和信噪比（NSR）等概念无法完全脱离样本的影响，所以无法纯粹地表征仪器本身的性能。

NIST的新模型通过引入一系列独立于样本的可量化性能指标，如线性上限 (ULL)、背景限 (LOB)、检测限 (LOD)、信噪比 (NSR) 和 定量限 (LOQ)，解决了这一痛点。

对于常规流式细胞仪，评估得到的这些指标被称为P-指标（population-metrics，群体指标）。虽然它们仍会包含校准微球的固有变异性（因为常规仪器无法像串行微细胞仪那样将仪器噪声和群体噪声完全分离），但其定义和计算方法却比传统方式更为严谨和客观，并提供了关于仪器性能的可操作信息。

2. 线性上限 (ULL) - 确保信号不“过载”

首先，我们需要确定仪器的线性上限 (ULL)。这是确保后续所有测量数据都处于检测器线性响应范围内的关键一步，避免信号饱和或非线性效应导致的数据失真。

操作步骤：
1.  准备多峰校准微球：使用如URCP-100-2H微球等多峰校准微球。
2.  多增益数据采集：在多个不同的增益设置下，测量这些微球的平均荧光强度（MFI）与制造商指定的荧光当量（MESF）数据。
3.  全局数据分析：采用全局数据分析策略，将所有增益下的数据进行合并分析。新模型会迭代拟合对数转换后的MFI-MESF关系曲线，并剔除残差最大的数据点，直到所有剩余数据点的相对误差低于预设阈值（例如10%）。
4.  确定ULL：ULL就是在此特定增益下，保持线性关系的最大MESF值。这一方法通过结合不同增益设置下的数据，大大增强了线性拟合的鲁棒性，使其更加稳定。

3. 下限测量指标 (LOB, LOD, LOQ) - 确认检测极限

接下来，我们需要量化背景限 (LOB)、检测限 (LOD) 和 定量限 (LOQ)，以了解仪器能够可靠检测和定量荧光信号的最低水平。

操作步骤：
1.  数据收集与模型拟合：继续使用多峰微球的数据，包括在不同增益下测量的MFI及其方差。通过最大似然估计（MLE）分析，将这些数据拟合到一个广义噪声模型中。这个模型不仅考虑了检测效率(Q)和背景(B)，还包括了通常被忽略的增益无关背景效应（如约翰逊-奈奎斯特噪声，用ω或γ表示），以及仪器和群体变异性的总和（用σ²表示）。
- 关键点：此模型同样采用全局数据分析策略，结合所有增益设置下的数据进行同时分析，这显著提高了Q和B估计的稳定性，并能更全面地量化其他噪声源的影响。在拟合过程中，会使用约束优化算法，确保所有参数（如Q、B、ω、σ²等）的估计值都是非负的，避免了传统方法中可能出现的负B值问题。
1.  计算P-指标：
- 背景限 (LOB)：最小的MESF值，背景事件产生高于此值的荧光信号的概率很低（例如小于5%）。它指示了通常预期出现噪声事件的区域。
- 检测限 (LOD)：最小的MESF值，在该值下，相关荧光强度有很高的概率（例如95%）高于LOB。它代表了群体可以被合理地认定为与噪声分离的最小MESF值。
- 定量限 (LOQ)：最小的MESF值，其对应的信噪比 (NSR) 低于预设阈值（例如10%）。

4. 信噪比 (NSR) - 优化操作的关键

信噪比 (NSR) 是一个无量纲的关键指标，用于量化总不确定性，是优化流式细胞仪操作的直接指南。

操作步骤与应用：
1、绘制NSR等高线图：根据拟合模型计算出的NSR值，生成MESF与相对增益的NSR等高线图。


2、解读：
- 图中右侧的红色区域表示MESF-增益组合高于ULL，应避免使用。
- 图中左侧的红色区域表示NSR接近1（单微球相对不确定度100%）的区域，同样应避免。
- NSR低于某一可接受阈值（例如0.1，对应10%的CV）的区域，即图中“绿色区域”界定了可自信进行单微球测量的操作条件范围。
- 利用这些图表，我们可以确定具有特定MESF的样本应使用的近似增益值，以确保仪器引起的噪声足够小，并且测量保持在线性范围内。

3、不确定性分解：新模型还允许将NSR的不确定性分解为背景噪声、散粒噪声、以及仪器和群体变异性等组成部分。这有助于操作者识别是哪些因素限制了测量精度，从而指导改进实验方案或仪器设计。对于常规仪器，主要评估的是包含微球群体变异性在内的P-指标。

5. 校准微球的选择

为了获得最准确的评估结果，选择合适的校准微球也很重要：
- 多峰微球：适用于对激光器和探测器配置进行广泛表征。
- 单荧光素微球：为了进行客观的仪器间比较，建议使用由单一荧光素浓度组成并经过正交验证的MESF（或ERF）值的校准微球，以避免多色微球带来的光谱重叠和MESF赋值歧义。



通过采用NIST开发的新模型和这些量化、客观的性能指标，常规流式细胞仪的操作者可以从过去的定性评估转向定量、客观和可操作的评估。这意味着你可以更精准地了解流式细胞仪的实际性能，优化实验条件，提高数据质量和可比性，并最终增强对实验结果的信心。

1. 参考文献：Patrone PN, Kearsley AJ, Catterton MA, Cooksey GA. Uncertainty Quantification of Fluorescence Signals in Flow Cytometry Part I: An Analytical Perspective Beyond Q and B. Cytometry A. Published online August 21, 2025. doi:10.1002/cyto.a.24955

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