关于免疫细胞分型的实际分析问题

火星海

这是我实际分析遇到的问题，上面这个样本是我于公共实验平台上进行测试的结果，现在我尝试在Flowjo上复现其结果，目前手头仅有定标时单染、空白及全染样本。我在复现时我发现如下问题：1、不同批次的样本死活染似乎界限不一致例如我上传的图一我在此处画门是否正确？这与我前几批测的样本死活染画门的位置都有所不同之前都有四十多的存活率。2、对于CD3阳性门的界定：我进行以下三个上游门Cells（FSC/SSC）、Singlets（FSC-A/FSC-H）、Live（活细胞）之后样本的全染管CD3的阴阳界限并不清晰（见P2），因此我在同样上游门之下以CD4单染管的阳性阈值来划全染管的CD4+细胞群阈值，接着将CD4+细胞群中的（95%-100%）相对分布位置划定全染管CD3+细胞群的范围请问这样是否可行呢？最后在CD3+细胞群中分画CD4+、CD8+见（P4）最终我同样没看见分群比较清晰的部分，因此还是以各单染管的阳性阈值界定的请问是否有更好的办法，在手头相对有限的数据上还是一定要补FMO。公共实验平台老师的画门图见最后。恳请老师指点

niwanmao

你的设门策略思路是对的，但是图4确实没有出现很好的一个分群，是不是前面哪个门设错了？

在仪器上 FACSDiva 的设门，我感觉还是有点问题，这些深红色的所谓 T 细胞，我看在死活染料那个图上，很多都是跟死细胞区域连在一起的，只有 F4/80 和 CD11b，这些信号基本都在活细胞区域

火星海

回复老师的第一个问题，门应该是没设错的，我做的是心脏组织的免疫细胞分群。我在想是不是细胞数过少了导致分群不明显；或者是我依据单染管CD3阳性阈值设定全染管CD3阳性阈值的行为是有问题的？这种情况想进一步设门是否是必须得补上FMO了呢？无法再依据CD4、CD8单染管的阳性阈值来划定全染管CD3+细胞群下CD4、CD8的阳性阈值？

火星海

还想进一步请教老师“这些深红色的所谓 T 细胞，我看在死活染料那个图上，很多都是跟死细胞区域连在一起的，只有 F4/80 和 CD11b，这些信号基本都在活细胞区域”这句话是怎么看出来的呢？谢谢老师  

niwanmao

火星海 发表于 2026-1-13 10:54
回复老师的第一个问题，门应该是没设错的，我做的是心脏组织的免疫细胞分群。我在想是不是细胞数过少了导致 ...

你用单染管CD3的阳性阈值来设置全染管的阈值，我觉得不太好

在全染管里面，CD3阳性群体有没有明显的出来？

如果全染管的CD3阳性群体没有出来的话，是不是得考虑染色的问题？

niwanmao

火星海 发表于 2026-1-13 10:58
还想进一步请教老师“这些深红色的所谓 T 细胞，我看在死活染料那个图上，很多都是跟死细胞区域连在一起的 ...

是看那些细胞群体对应颜色的分布区域

ZRX

这种分群不明显的数据 最好使用多边形门 矩形门有时候不太准

ZRX

淋巴细胞较小 不要再第一张那个图上全部圈门，逐渐缩小FSC SSC然后看死活的位置和其他门控的分群

火星海

niwanmao 发表于 2026-1-13 11:12
你用单染管CD3的阳性阈值来设置全染管的阈值，我觉得不太好

在全染管里面，CD3阳性群体有没有明显的出来 ...

好的学到了老师，我再继续研究一下

火星海

ZRX 发表于 2026-1-13 13:05
这种分群不明显的数据 最好使用多边形门 矩形门有时候不太准

好的谢谢老师！！