标题：ANNEXIN V-PI法检测凋亡的原理和相关试剂盒使用步骤
一、原理
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
二、常见试剂盒组份
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组份
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Annexin V-FITC
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50μL
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100μL
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250μL
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500μL
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Binding Buffer
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5 mL
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10.0 mL
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25 mL
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25 mL×2
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Propidium Iodide （PI）
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50μL
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100μL
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250μL
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500μL
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三、操作步骤
1． 悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；
2． 用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1~5×105细胞；
3． 加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；
4． 加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀；
5． 室温、避光、反应5～15min；
6． 请在1 hour内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。
A． 荧光显微镜观察
1． 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；
2． 对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；
（1） 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；
（2） 用PBS洗涤细胞两次；
（3） 在500μL 的Binding Buffer中加入2μL Annexin V-FITC， 5 μL Propidium Iodide，混匀；
（4） 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；
（5） 避光、室温反应5 min。
3． 将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片（FITC和罗丹明）观察
Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。
B． 流式细胞仪分析
用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。
荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
四、注意事项
1． Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。
2． Propidium Iodide （PI）有毒，操作时要戴手套。
3． 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，，不适用于检测组织样本。
4． 推荐使用悬浮培养细胞，如果是贴壁细胞，用胰酶消化不当，会引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2\%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。
5． 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。
五、储存 置于40C，可保存一年
发表于 2010-8-1 19:13:54
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