求指导：backman XL点状图出现漂移、分散的原因

刘星宇

经刺激处理的全血样本，孵育抗体，然后加自己配制的氯化铵红细胞裂解液裂解15min，500g离心5min，PBS（含1%BSA和0.1%NaN3）洗涤1~2次，最后重悬400μl，但上机检测发现点状图中性粒细胞分群很不好，不集中，像是“漂移”了，但如果裂解红细胞后不去除裂解上清液，直接上机，则细胞分群就很好，请问①是什么原因。

但这样同型对照的背景就很高，百分比达40%~60%（以不染色管设门），检测管也到了80%~90%（100μl全血加入10μl抗体（25μg/ml），2ml红细胞裂解液）。

然后减少抗体至1μl，同型对照百分比则降到1%~2%。

请问②是什么原因造成背景高？抗体多了？多余的抗体附在红细胞碎片中也会导致百分比增高？
③这样裂解红细胞后直接上机检测的方法是否不对？

楼楼

可能跟溶血素有关系，用氯化铵的方法在XL的机器上效果会差一点，用甲酸或是Beckman的商品化溶血剂可能效果会好一些。如果FS/SS不好，建议加CD45。

niwanmao

我们这么处理：
裂红后尽量去光上清，直接加200ul左右的PBS，上机检查。

如果你把裂红的上清不去掉，那么里面游离的抗体可能会干扰检测的荧光。

刘星宇

niwanmao 发表于 2013-7-30 14:25

                               
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我们这么处理：
裂红后尽量去光上清，直接加200ul左右的PBS，上机检查。

倪老师好，去掉裂解上清液后，PBS重悬，背景的确降下来了，1%左右，但点状图就很散了，很难圈出中性粒。原来在canto 2做，没有这种情况的。

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-7-30 16:09

                               
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倪老师好，去掉裂解上清液后，PBS重悬，背景的确降下来了，1%左右，但点状图就很散了，很难圈出中性粒。 ...

跟原来在canto II上同样的处理方式吗？会不会是其它原因？

有图么？

刘星宇

结果图在老师手机，我还没有拷数据。就是想不明白同样的处理，在XL机子上，洗涤重悬的细胞点状图就分散了，而裂掉红细胞后直接上机检测却能够分群好。

刘星宇

有老师怀疑跟低温有关，然后抗体孵育、PBS都是在室温的，结果还是那样。
机子上样胶圈的密闭性不好，有漏气，难道与鞘液逆流有关？似乎也不对，裂红后直接上机也是漏气的啊。

didi_zhou

重新配置一下PBS试试看，或者换个离心机，不洗就没问题，说明问题在洗涤这步，跟机器没什么问题。点状图分不好是FS/SS还是SS/CD45，FS/SS分不好可以试试SS/45应该不会有问题。

刘星宇

didi_zhou 发表于 2013-7-31 12:30

                               
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重新配置一下PBS试试看，或者换个离心机，不洗就没问题，说明问题在洗涤这步，跟机器没什么问题。点状图分 ...

换了新的PBS，也用过培养细胞专用的商品化PBS，也用过培养基重悬，最后还是一样，离心力调小到400g（1500转左右），还是点状图分散，也不像是跟培养过有关系啊。准备到另外实验室再看看，可惜那老师休假了，我也休休假吧

刘星宇

楼楼 发表于 2013-8-5 10:13

                               
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可能跟溶血素有关系，用氯化铵的方法在XL的机器上效果会差一点，用甲酸或是Beckman的商品化溶血剂可能效果 ...

倒没有考虑过这个问题，但不明白为什么氯化铵裂解红细胞后直接上机细胞就没有分散。原来用canto 2检测时加了CD45的，结果尚可，但现在XL机子太老了，补偿调不起来。
我们换裂解液再试试，谢谢！