四组实验结果——贴壁细胞凋亡检测问题

Beckman6029

各位老师好！

在做流式凋亡检测过程中遇到些问题，

我先将具体实验步骤设计和结果交代下：

实验步骤：

同时进行四组实验

第一组：细胞未进行任何处理（未给药），贴壁细胞培养72h后经吹打后离心，直接使用D-Hanks缓冲液重悬后上机检测（未使用凋亡试剂盒）。以用来调整FL1和FL3电压，摸清荧光背景值。

注：考虑到胰酶消化不当会使得细胞损伤甚至死亡，而本实验用到的细胞培养到48-72h（密度较大）时可以比较容易用枪吹打下来。故选择直接使用1ml枪吹打下来进行后续操作。

第二组：细胞未进行任何处理（未给药），贴壁细胞培养72h后经吹打后离心，按凯基凋亡试剂盒（货号：KGA107）说明书进行染色操作，后上机检测【孵育至上机过程均注意避光】。

凯基凋亡试剂盒说明书：http://www.keygentec.com.cn/productdetails/288.html

第三组：接种24h后对细胞进行药物A处理48h，贴壁细胞经吹打后离心，按凯基凋亡试剂盒（货号：KGA107）说明书进行染色操作，后上机检测【孵育至上机过程均注意避光】。

第四组：接种24h后对细胞进行药物B处理48h，贴壁细胞经吹打后离心，按凯基凋亡试剂盒（货号：KGA107）说明书进行染色操作，后上机检测【孵育至上机过程均注意避光】。

四组实验上机条件一致，均计数2万个细胞，电压及其他参数设置也均一致。

实验结果：

                                                          图中对应详细数值

组别	选定细胞/计数	Q1（Dead）	Q2（Apoptotic）	Q3（Viables）	Q4（Early apoptotic）
第一组	69.99%	0.01%	0.01%	99.98%	0.00%
第二组	81.11%	3.72%	1.57%	93.47%	1.25%
第三组	84.59%	10.46%	5.77%	80.94%	2.83%
第四组	84.40	9.31%	1%	83.31%	6.39%

由于本人是新手，对于本次实验存在以下问题，望各位老师能帮我分析分析：

1、  从流式细胞图和表相关数值来看，不知道凋亡试剂盒的两种染料Annexin V-FITC和PI是否成功着色？

2、  作为阴性对照组的第二组，为什么死亡和凋亡均存在且比例不小，难道是由于细胞培养了72h密度较大的缘故，细胞自然凋亡了？但是药物需要作用那么长时间，且细胞接种密度也挺稀的。不知道具体是什么原因，有何好解决办法？

3、  从第一组的流式图和表相关数值来看，不知道现在使用的FL1和FL3的电压值是否恰当。

4、  FL1和FL3流式细胞峰值图中，不同颜色峰代表什么意思，例如第三组的FL1峰值图中，绿色的大峰下面为什么会有一个红棕色的小峰，且该红棕色的小峰较第二组（对照组）大很多。

5、  如果本实验一切条件都没有问题，那从流式细胞结果图和数值可以得到何结论？

万分痛苦中，各位老师能提供些雪中之炭。这里有一声谢谢！！

niwanmao

首先对你做的图表示一个赞！真的很清楚，这样的问题看起来都特别舒服

这些问题就集中到一起回答，因为有些重复。
首先，你的染色没有问题；其次散点图的十字门建议竖线按照下图的蓝线这样画更好，因为这个位置是分群最好的；再次，对照组这个比例是属于可以接受的，是贴壁细胞无法避免的物理损伤，没有问题；最后，建议分析还是只画散点图即可，直方图没有意义。

Beckman6029

首先，谢谢倪老师这么快的回复！
并就倪老师对论坛的付出和贡献表示敬意!

已经看过倪老师精彩的回答，
也解决了不少以前想不通的问题。
因为我一直怀疑Annexin V-FITC是否成功染色。
在做实验组B之前感觉一直没有看到明显的早期凋亡即Q4细胞群。
目前还有一些细节问题没搞懂：
1、散点图的十字门精确划分原则方法。
2、第四组FL1&FL3中的早期凋亡Q4算是明显的细胞群吗？总感觉点很散。
3、还是第一贴中提到的细节：FL1和FL3流式细胞峰值图中，不同颜色峰代表什么意思，例如第三组的FL1峰值图中，绿色的大峰下面为什么会有一个红棕色的小峰，且该红棕色的小峰较第二组（对照组）大很多。

Beckman6029

关于如何设门的方法和原理已认真学习了吴老师上传的PDF详细介绍
http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... 8&fromuid=24981
收获颇多啊。。。。

wwyangxu

倪老师好，我想问一下如何判断染色有没有问题？谢谢！

wwyangxu

niwanmao 发表于 2013-12-17 20:25
首先对你做的图表示一个赞！真的很清楚，这样的问题看起来都特别舒服

这些问题就集中到一起回答， ...

倪老师好，我想问一下如何判断染色有没有问题？，还有就是楼主的十字门图的细胞为什么出现好几种颜色，这和软件设置有关吗？谢谢！

niwanmao

wwyangxu 发表于 2014-9-14 18:09
倪老师好，我想问一下如何判断染色有没有问题？，还有就是楼主的十字门图的细胞为什么出现好几种颜色， ...

颜色跟设的门有关。